人工牛黃膽紅素含量測定的分析方法驗證

余 艷 袁少欽 劉 微 陳小燕

（揚子江藥業集團江蘇制藥股份有限公司，江蘇 泰州 225300）

人工牛黃收載在《中國藥典》2015版一部，由牛膽粉、豬去氧膽酸、膽紅素、膽酸、膽固醇、牛磺酸、微量元素等加工制成[1-4]，其味苦，微甘。具有抗炎，清心，污血散結，豁痰，息風，解毒[3]等功效。該實驗按《中國藥典》2015版對人工牛黃膽紅素的含量測定[4]進行方法驗證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Evolution 300紫外分光光度計（Thermo Fisher），VISIONpro工作站，XP205電子天平（METTLER-TOLEDO）。

1.2 試藥：三氯甲烷（AR，來源：國藥集團，批號：20131210）。

1.3 樣品：人工牛黃（來源：四川協力制藥有限公司，批號：C026A160802）。

1.4 對照品：膽紅素（英文名稱：Bilirubin，來源：中國藥品生物制品檢定所，批號：100077-200805，分子量：584.66，Content 99.6%）。

2 膽紅素含量測定

2.1 對照品溶液的制備：避光操作。

用XP205電子天平稱定，膽紅素對照品約10 mg（不得低于10 mg），再往量瓶中加入試劑三氯甲烷約80 mL，超聲進行處理，使其能充分溶解，然后用試劑三氯甲烷稀釋并定容至100 mL，振搖，使均勻，得對照品貯備液（每1 mL中約含膽紅素100 μg）。用移液管移取，上述已搖勻貯備液10 mL，加試劑三氯甲烷稀釋并定容至50 mL，振搖，使均勻。

2.2 人工牛黃供試品溶液制備：用XP205電子天平稱定，人工牛黃供試品約80 mg，再往量瓶中加入試劑三氯甲烷約80 mL，超聲進行處理，使其能充分溶解，然后再用試劑三氯甲烷稀釋，并定容至100 mL，振搖，使均勻。將上述的溶液用定量濾紙濾過，棄去初濾液，取續濾液，作為供試品溶液。照紫外—可見分光光度法（0401）[5]，測定其在λ=453nm波長處的吸光度，然后根據標準曲線讀出人工牛黃供試品溶液中含膽紅素的量，計算，即得。

2.3 線性（樣品準備）：用移液槍分別移取，對照品溶液4 mL、5 mL、6 mL、7 mL及8 mL于量瓶中，并分別用試劑三氯甲烷稀釋并定容至25 mL，振搖，使均勻。照紫外—可見分光光度法（0401）[5]，測定其在λ=453 nm處的吸光度，并以C（濃度）為橫坐標，A（吸光度）為縱坐標，繪制標準曲線。

2.4 重復性考察：按上述1.2.項下人工牛黃供試品溶液制備方法，重復制備人工牛黃供試品溶液6份，并以試劑三氯甲烷作為空白溶液。照1.3.項下線性（樣品準備）的方法，依法測定其吸光度。再根據膽紅素重復性標準曲線，分別讀出6份人工牛黃供試品溶液中含膽紅素的量，計算，即得。分別計算，6份人工牛黃溶液的測定值，其結果相對平均偏差應不得過2.0%。膽紅素重復性考察相關數據見表1。

表1 膽紅素重復性考察相關數據

2.5 專屬性考察：分別取上述1.2.項下人工牛黃供試品溶液制備方法項下制備的供試品溶液及對照品溶液各1份，照紫外-可見分光光度法（0401）[5]，測定其在433～473 nm的A（吸光度），并且在453nm±2 nm波長處應該有最大吸收。

2.6 回收率試驗[5]溶液制備：回收率項下膽紅素對照品溶液貯備液的制備：用XP205電子天平稱定，膽紅素對照品約38 mg，加適量試劑三氯甲烷，超聲進行處理，使其溶解充分，然后再用試劑三氯甲烷稀釋并定容至100 mL，振搖，使均勻。用移液管移取，上述已搖勻溶液5 mL，再加試劑三氯甲烷溶液稀釋定容至50 mL，振搖，使均勻，即得膽紅素對照品溶液貯備液。

人工牛黃供試品溶液的制備：用XP205電子天平稱定6份，人工牛黃供試品約80 mg，分別加入對照品溶液貯備液1 mL及試劑三氯甲烷80 mL，超聲進行處理，使其溶解充分，然后再用試劑三氯甲烷稀釋定容至100 mL，振搖，使均勻。將上述溶液用定量濾紙濾過，棄去初濾液，取續濾液。照紫外-可見分光光度法（0401）[5]，測定其在λ=453 nm波長處的A（吸光度）。回收率試驗相關數據見表2。

表2 回收率試驗相關數據

3 結 論

按照藥品質量標準分析方法驗證指導原則[5]的相關要求，本文從線性、重復性、專屬性以及回收率等方面對《中國藥典》2015版一部人工牛黃膽紅素的分析方法進行驗證。經過試驗，表明該方法可以準確測定人工牛黃膽紅素的含量，測得結果為0.659%，且同一濃度的6份供試品具有良好的重復性，在452nm處有最大吸收波長，回收率為97%，符合標準規定。