甲基納曲酮對肝癌HepG2的VEGF的mRNA表達的抑制作用

伍天影 阮林

【摘要】目的：觀察甲基納曲酮對肝癌HepG2細胞VEGF的mRNA的影響。方法：分別將含0.01μmol甲基納曲酮（低劑量組）、0.05μmol（中劑量組）、0.1μmol（高劑量組）培養基與肝癌HepG2細胞共孵72h，以等體積生理鹽水處理組設立空白對照組。應用RT-βCR檢測肝癌HepG2細胞中VEGF基因表達水平。結果：RT-βCR顯示，甲基納曲酮高劑量處理組作用72h的胞VEGF在mRNA水平表達均較對照組下調，低濃度組、中濃度組、高濃度組分別為0.75±0.03，0.58±0.05，0.47±0.04，各組均與對照組相比具有顯著性差異（F=107.9，p=0.000），且具有時間依賴關系。結論：甲基納曲酮能夠下調肝癌HepG2細胞VEGF在mRNA的表達。

【關鍵詞】肝癌；甲基納曲酮；mRNA；血管內皮生長因子

肝癌是全球第五大癌癥，其死亡率排世界第二m在肝癌的分型中，原發性肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma HCC）占據了90%以上，因其高發率和異質性引起廣泛關注Iz]在癌癥患者自覺癥狀中，癌性疼痛是癌癥患者常出現的主要癥狀之一，晚期癌癥患者中有70%～90%者伴有不同程度癌痛，其中中度疼痛占50%，重度疼痛占30%[3]。甲基納曲酮（MNTX）是首個用于瀉藥治療OIC無效時用于臨床的阿片類藥物拮抗劑。而本篇著重探討甲基納曲酮肝癌HepG2細胞VEGF的mRNA的影響，對肝癌患者的治療及疼痛管理將有所參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肝癌細胞株HepG2由廣西醫科大學附屬腫瘤醫院中心實驗室提供。血清購于gibco公司。DMEM培養基購自gibco公司。逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自Toyobo公司。TRIzol Reagent購自Invitrogen公司（美國）；PCR primer廣州艾基生物合成，并PAGE純化。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

HepG2人肝癌細胞培養于含10%胎牛血清DMEM培養液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養、傳代。

1.2.2 熒光定量

PCR檢測VEGF mRNA表達水平。以0.01μmol甲基納曲酮、0.05μmol甲基納曲酮、0.1gmol甲基納曲酮作用于肝癌HepG2細胞，同時以等體積生理鹽水處理組為空白對照組。各組分別培養72h后，以Trizol法提取細胞總RNA，測RNA含量、濃度。按逆轉錄試劑盒說明書進行操作，獲得cDNA。熒光定量PCR用SYBRGreen染料為熒光檢測信號，熒光實時定量聚合酶鏈反應（Real-time quantitativepolymerase chain reaction，RT-qPCR）在八聯管中反應，每組每個基因設3個復孔。RT-qPCR引物見表to反應條件：95℃預變性2min，95℃變性15s，60℃退火并延伸30s，共40個循環。數據采用2-△△Ct法進行分析。每次實驗設3個副孔，重復3次。

2 結果

2.1 肝癌HepG2細胞VEGF的檢測結果

作用72h后肝癌HepG2細胞的VEGF在mRNA水平表達低濃度組、中濃度組、高濃度組相對表達量分別為0.75±0.03、0.58±0.05、0.47±0.04。各組均與對照組相比具有顯著性差異（F=107.9，p=0.000），且具有時間依賴關系。

3 討論

癌癥所致的疼痛極大地降低了癌癥患者的生存質量。因此疼痛需要規范的治療[4]。阿片類藥物導致的胃腸道功能障礙主要由于μ阿片受體作用于胃腸道導致，最常用的減輕阿片類藥物性便秘的是使用通便的瀉藥，但使用不當時很可能無效[5]。阿片類受體拮抗劑作為治療OIC的藥物的發展。這些阿片受體拮抗藥物可以特異性結合μ阿片受體的外周阿片受體，從而有效地制約了胃腸道外周作用。甲基納曲酮在臨床上是一種廣泛使用的阿片類受體拮抗藥，常用于使用阿片類藥物治療癌痛和術后鎮痛導致的便秘并且不影響其中樞鎮痛作用。有研究表明甲基納曲酮對于前列腺癌具有一定的抑制作用，其在肝癌中的作用還未見報道。

VEGF是一種肝素結合內皮細胞生長因子，對血管內皮細胞生長因子特定體內能誘導血管生成[6]有研究表明相比較于肝癌患者的VEGF（-）/（+）群體，VEGF（++）/（+++）群體在有遠處轉移，血管侵犯，AFP>400ng/m占據的比例顯著更大，且VEGF的過表達與患者的轉移，血管侵犯，生存率有關[7]。熒光定量PCR檢測，作用72h后肝癌HepG2細胞的VEGF在mRNA水平表達低濃度組、中濃度組、高濃度組分別為0.75±0.03、0.58±0.05、0.47±0.04，各組均與對照組相比具有顯著性差異（F=107.9，p=0.000），且具有時間依賴關系。甲基納曲酮可以下調HepG2人肝癌細胞的VEGF在mRNA水平上的表達。本研究為臨床上在治療肝癌患者時應用甲基納曲酮提示了方向。

（通訊作者：阮林）

參考文獻

[1]Jemal，A.，et al.，Global cancerstatistics.CA Cancer.TClin，2011，61（02）：p.69-90.

I2]Wang，Y.，et al.，The long noncodingRNA 1ncTCF7 promotes self-renewal of human liver cancerstem cells through activationof Wnt signaling.Cell StemCell，2015，16（04）：p.413-25.

[3]Swarm，R.A.，et al.，Adultcancer pain.d Natl Compr Cane Netw，2013.11（08）：p.992-1022.

[4]Apolone，G.，et al.，Pattern andquality of care of cancerpain management.Results fromthe Cancer Pain OutcomeResearch Study Group.B r.TCancer，2009，100（10）：p.1566-74.

[5]Cherny，N.I.，et al.，Formularyavailability and regulatorybarriers to accessibility ofopioids for cancer pain inEurope：a report from the ESMO/EAPC Opioid Policy Initiative.Ann Oncol，2010，21（03）：p.615-26.

[6]Leung，D.W.，et al.，Vascularendothelial growth factor is asecreted angiogenic mitogen.Sciencc，1989，246（4935）：p.1306-9.

[7]Choi，S.B、，et al.，VEGFOverexpression Predicts PoorSurvival in HepatocellularCarcinoma.Open Med（Wars），2017.12：p.430-439.