基于Image J軟件的裸鼠肝臟原位腫瘤圖像定量分析方法

姜棋予，陳艷，李瑞生，孫慧偉，李曉娟，柴燕濤，王志杰，楊銳創(chuàng)，張瑩石，馮帆，侯俊

解放軍第三〇二醫(yī)院 臨床研究管理中心，北京 100039

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等在我國有很高的感染率，隨著時(shí)間的推移以及疾病的逐漸進(jìn)展，這些患者有很大的風(fēng)險(xiǎn)最終罹患肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），這使得肝細(xì)胞癌不僅嚴(yán)重危害我國人民健康，也是現(xiàn)階段公共衛(wèi)生事業(yè)的重大挑戰(zhàn)[1]。目前，進(jìn)展期肝細(xì)胞癌的藥物治療面臨巨大挑戰(zhàn)，這集中體現(xiàn)在：①進(jìn)展期肝細(xì)胞癌對(duì)各種傳統(tǒng)化療藥物均極不敏感[2]；②現(xiàn)有治療策略是各種口服分子靶向藥物，但這些藥物價(jià)格昂貴，療效在患者個(gè)體間的差異也很大[3]。因此，進(jìn)展期肝細(xì)胞癌分子靶向藥物的研發(fā)歷來是研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。利用裸鼠等動(dòng)物模型建立肝細(xì)胞癌腫瘤模型，是進(jìn)展期肝細(xì)胞癌分子靶向治療相關(guān)分子腫瘤學(xué)研究、分子藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)。

盡管已經(jīng)取得了諸多進(jìn)展，但現(xiàn)有動(dòng)物研究模型仍存在諸多不足：①裸鼠皮下腫瘤盡管是一種在體（in vivo）研究模型，但惡性腫瘤細(xì)胞在裸鼠皮下的生長與其在肝臟原位的實(shí)際生長狀態(tài)有較大差異；②進(jìn)展期肝細(xì)胞癌具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移與侵襲能力，尚無可靠與直觀的在體研究模型可對(duì)此進(jìn)行研究，需要建立更加直觀和行之有效的腫瘤動(dòng)物模型；③分子靶向藥物相關(guān)藥理學(xué)、藥效學(xué)研究對(duì)結(jié)果的量化分析有較高要求，但現(xiàn)有研究策略更適用于定性研究，對(duì)定量研究的技術(shù)與方法儲(chǔ)備不足，難以對(duì)腫瘤組織、臟器等照片文件進(jìn)行定量分析。為解決這些問題，我們利用高侵襲性的肝細(xì)胞癌細(xì)胞MHCC97-H，經(jīng)由肝門靜脈注射接種裸鼠肝臟后形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶（nodules），利用Image J軟件對(duì)肝臟臟器照片進(jìn)行定量分析，可精確測(cè)定腫瘤病灶的面積以反映腫瘤大小與臟器病變程度。在此基礎(chǔ)上，我們利用該技術(shù)進(jìn)行了索拉非尼的藥敏實(shí)驗(yàn)，獲得了索拉非尼抗腫瘤作用的定量結(jié)果（對(duì)MHCC97-H在裸鼠肝臟形成病灶的抑制率）。

1 材料與方法

1.1 材料

免疫缺陷小鼠（BALB/c品系的胸腺缺失小鼠）購自北京市斯貝福生物科技有限公司，吸入麻醉劑異氟烷購自深圳沃瑞德公司，小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)手術(shù)器械由本實(shí)驗(yàn)室保存；高侵襲性人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系MHCC97-H為本實(shí)驗(yàn)室保存，用含10%胎牛血清（Invitrogen公司產(chǎn)品）的DMEM培養(yǎng)液（Invitrogen公司產(chǎn)品）培養(yǎng)；病理實(shí)驗(yàn)Masson染色試劑盒為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；圖像分析軟件為Adobe Photoshop（版本號(hào)CS6 13.0×64）和Image J軟件（版本號(hào)1.51j8，由美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)布）；DMSO、吐溫80及PEG400等均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 免疫缺陷小鼠肝臟原位腫瘤模型的建立[4]

培養(yǎng)MHCC97-H細(xì)胞，待其狀態(tài)良好后，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用注射用水（滅菌的生理鹽水）重懸，備用；雌性5～6周齡BALB/c品系免疫缺陷小鼠在潔凈空間（SPE飼養(yǎng)條件）用經(jīng)60Co-γ照射除菌的飼養(yǎng)墊料和飼料進(jìn)行飼養(yǎng)。用吸入麻醉劑異氟烷在麻醉機(jī)持續(xù)麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（首次麻醉時(shí)異氟烷濃度為3.5%，持續(xù)麻醉時(shí)異氟烷濃度為1.5%～2.0%）。將麻醉的小鼠固定于粘鼠板上，在其腹部劍突下方剪開一個(gè)約1.5 cm的開口，輕輕擠出肝右葉后暴露肝門靜脈，用醫(yī)用注射器（滅菌注射器）在肝門靜脈中注射MHCC97-H細(xì)胞懸液，注射的總體積為 100～200 μL，細(xì)胞量為 5×105。接種完畢，將肝葉推回腹腔內(nèi)進(jìn)行縫合，注意縫合的層次并縫合3～4針即可。如有少量出血?jiǎng)t進(jìn)行按壓止血。

1.3 肝臟腫瘤多發(fā)與彌散病灶照片的定量分析

收集動(dòng)物，獲得肝臟臟器，拍照獲得垂直視角圖片。同時(shí)收集組織標(biāo)本，將其制備為石蠟切片，進(jìn)行Masson染色實(shí)驗(yàn)，對(duì)腫瘤病灶進(jìn)行確認(rèn)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)拍照所得的肝臟臟器照片進(jìn)行圖像定量分析：①用Photoshop軟件打開獲得的肝臟腫瘤垂直視角拍攝圖片，用軟件工具欄中的“磁性套索工具”，沿圖片中小鼠肝臟邊緣進(jìn)行選取，復(fù)制所選區(qū)域粘貼于黑色背景中，保存圖片；②將①中獲得的黑色背景照片用Image J軟件打開，點(diǎn)擊路徑ImageColorSplit Channels，可獲得圖片的紅（R）、綠（G）、藍(lán)（B）等3個(gè)RGB象限分析結(jié)果；③由于肝臟臟器在圖片中呈現(xiàn)的主色調(diào)接近紅色，為保證腫瘤顏色與腫瘤本體顏色的色差，故選取綠色或藍(lán)色為下一步操作的圖像，本次操作以綠色為操作圖像；④點(diǎn)擊菜單ImageAdjustThreshold路徑，將第二排滾動(dòng)條拖動(dòng)至顯示數(shù)值為“255”，第一排滾動(dòng)條拖動(dòng)至紅色基本覆蓋腫瘤部位，可確定腫瘤部位占整個(gè)圖片的比例；⑤進(jìn)一步，將第一排滾動(dòng)條向左拖動(dòng)，至數(shù)值顯示為“1”，可確定肝臟臟器占整個(gè)圖片的比例。

1.4 分子靶向藥物敏感性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

對(duì)前述獲得的動(dòng)物模型進(jìn)行分子靶向治療，將裸鼠分為2組，即對(duì)照組（未治療組）和索拉非尼治療組（灌胃給予2 mg/kg的索拉非尼，隔日給藥）。待治療10次（飼養(yǎng)3周左右）后，收集動(dòng)物獲得肝臟臟器，拍照后對(duì)圖像進(jìn)行定量分析，依據(jù)對(duì)照組與索拉非尼治療組腫瘤組織占肝臟總面積的比例，計(jì)算索拉非尼作用于MHCC97-H細(xì)胞在裸鼠肝臟形成腫瘤病灶的抑制率：抑制率=（未治療組腫瘤病灶面積-治療組腫瘤病灶面積）/未治療組腫瘤病灶面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果顯示為x±SD，用SPSS17.0軟件，采用單因素方差分析計(jì)算P值，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 MHCC97-H細(xì)胞能夠在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶

結(jié)果如圖1所示，經(jīng)由肝門靜脈注射MHCC-97H細(xì)胞，可在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶（圖1A）。在此基礎(chǔ)上對(duì)肝臟標(biāo)本進(jìn)行病理染色（Masson染色）（圖1B），能夠清晰和直觀地顯示腫瘤組織與周圍正常組織，對(duì)圖1A的結(jié)果進(jìn)行了確證。

2.2 裸鼠肝臟多發(fā)與彌散腫瘤病灶的圖像定量分析

首先，用Photoshop軟件沿鼠肝臟邊緣進(jìn)行選取，復(fù)制所選區(qū)域并粘貼后獲得了背景為黑色的圖片（圖2A），用Image J軟件獲得了圖片的RGB象限分析結(jié)果（圖2B、C、D）。在此基礎(chǔ)上，分別獲得了腫瘤組織（圖3）與肝臟臟器整體（圖4）占整個(gè)圖片面積比例。其中腫瘤組織占圖片總面積的37.34%（圖3），而肝臟臟器占圖片總面積的75.05%（圖4），因此，HCC病灶占肝臟臟器總面積的49.75%（37.34%/75.05%）。這表明，建立了基于圖像分析軟件Image J的肝臟臟器照片定量分析方法。

2.3 分子靶向藥物索拉非尼抗腫瘤作用的圖像定量分析

如前述，我們建立了對(duì)裸鼠肝臟腫瘤病灶的定量分析方法。在此基礎(chǔ)上將其運(yùn)用于藥物索拉非尼抗腫瘤作用的圖像定量分析，結(jié)果如圖5所示，經(jīng)由門靜脈注射接種MHCC97-H細(xì)胞能夠在裸鼠肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶，圖5A為肝臟臟器照片，索拉非尼治療能夠顯著抑制MHCC97-H細(xì)胞在裸鼠肝臟中形成腫瘤病灶的能力，未治療組（對(duì)照組）5個(gè)臟器中，腫瘤病灶所占比例（即相對(duì)面積）分別為57.6%、62.2%、53.1%、49.7%和44.9%，而索拉非尼治療組MHCC97-H細(xì)胞在肝臟形成的腫瘤病灶顯著縮小，其占肝臟臟器的比例依次為14.2%、16.2%、10.6%、7.9%和23.8%。圖5B為上述定量分析結(jié)果的散點(diǎn)圖，圖5C為依據(jù)數(shù)據(jù)所得索拉非尼作用于MHCC97-H細(xì)胞在肝臟形成腫瘤病灶的抑制率散點(diǎn)圖。這表明，利用建立的圖像分析方法可輔助藥物敏感性研究，定量分析所得照片等圖像文件。

圖1 肝門靜脈注射MHCC97-H細(xì)胞后能夠形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶

圖2 肝臟照片的選定及像限分析結(jié)果

圖3 HCC腫瘤病灶的識(shí)別與總面積的定量分析

圖4 肝臟臟器總面積的識(shí)別與肝臟面積的定量分析

圖5 索拉非尼對(duì)MHCC97-H細(xì)胞在裸鼠肝臟形成腫瘤病灶的抑制作用

3 討論

目前，受臨床診療技術(shù)的限制，大多數(shù)HCC患者初診即為進(jìn)展期，失去了外科手術(shù)等根治性治療的機(jī)會(huì)。由于進(jìn)展期肝細(xì)胞癌對(duì)射線等放射治療策略極不敏感，加之其對(duì)傳統(tǒng)化療藥物也不敏感，因此臨床診療受到極大限制，患者預(yù)后較差[5]。現(xiàn)有治療藥物主要是索拉非尼[6]、瑞戈非尼[7]及阿帕替尼[8]等分子靶向藥物。索拉非尼已廣泛用于臨床，其藥物耐受與毒副作用已有明確報(bào)道，瑞戈非尼與阿帕替尼也于近期獲準(zhǔn)上市。因此，對(duì)這些分子靶向藥物的研究具有重要意義。但現(xiàn)有研究模型存在諸多不足：①對(duì)于皮下腫瘤可測(cè)算其腫瘤體積進(jìn)行量化分析，但對(duì)于其他腫瘤模型，如肝臟原位腫瘤模型，獲得照片等圖像信息較為容易，而對(duì)圖形信息進(jìn)行定量分析較為困難；②以高內(nèi)涵（high content analysis）等為代表的圖像采集與分析系統(tǒng)對(duì)于圖形文件格式等的要求較為嚴(yán)格，整個(gè)工作站價(jià)格昂貴，普及性差[9-10]。為此，本研究建立了一種基于Image J軟件的圖像定量分析方法。將MHCC97-H細(xì)胞經(jīng)由肝門靜脈注射裸鼠肝臟，能夠在肝臟形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶，用Image J軟件可特異和完整地將肝臟輪廓與多發(fā)與彌散的腫瘤病灶加以識(shí)別和選定，進(jìn)而確定臟器、病灶的面積，二者的比值（即病灶占臟器總面積的比例）即可量化和直觀地反映MHCC97-H細(xì)胞在裸鼠肝臟形成病灶的強(qiáng)度。

進(jìn)展期肝細(xì)胞癌具有強(qiáng)烈的侵襲性生長與血管侵犯等病理特征[11]，因此本研究選取了MHCC97-H細(xì)胞這一高侵襲性的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系模擬與反映進(jìn)展期肝細(xì)胞癌具有的強(qiáng)烈的侵襲性生長特征。我們通過肝門靜脈注射接種的方式，實(shí)現(xiàn)了MHCC97-H細(xì)胞在肝臟的血道轉(zhuǎn)移與侵襲性生長，MHCC97-H細(xì)胞在裸鼠肝臟形成了多發(fā)與彌散的腫瘤病灶。與現(xiàn)有腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲模型相比，本研究采取的模型具有諸多優(yōu)勢(shì)：①現(xiàn)有腫瘤轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型主要是通過尾靜脈接種腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞通過下腔靜脈回心后，立即經(jīng)由肺動(dòng)脈抵達(dá)肺部[12]。盡管能夠獲得肺部的腫瘤病灶，但肺部作為氣體交換的器官有豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，腫瘤細(xì)胞經(jīng)由血液循環(huán)路徑直接和非特異地留駐與毛細(xì)血管等微循環(huán)部位，不能特異性地反映出腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移、侵襲過程中的各項(xiàng)生理變化；②腫瘤細(xì)胞經(jīng)由肝門靜脈進(jìn)入肝臟，能夠直接實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在肝臟內(nèi)部的留駐，模擬肝轉(zhuǎn)移。肝臟血管豐富，內(nèi)部分布有大血管，而接近肝包膜處毛細(xì)血管豐富。肝臟較薄，留駐于近肝包膜處的MHCC97-H細(xì)胞隨著其侵潤性生長最終會(huì)突破肝包膜，在肝臟表面形成多發(fā)與彌散的腫瘤病灶；③本研究建立的腫瘤模型，不僅能夠更好地模擬腫瘤細(xì)胞在肝臟原位的轉(zhuǎn)移與侵潤性生長，也適用于肺癌肝轉(zhuǎn)移、乳腺癌肝轉(zhuǎn)移等領(lǐng)域的研究。綜上所述，本研究建立的方法，不僅有助于模擬肝細(xì)胞癌在肝臟原位的生長，也對(duì)相關(guān)藥學(xué)研究具有重要意義。