表皮生長因子受體在三陰性乳腺癌細胞膜表面的電鏡單分子成像研究

張曉菲,王麗,李勁濤,夏陽,吉元,盛望,韓曉東

北京工業大學 a.生命科學與生物工程學院；b.固體微結構與性能研究所；北京 100124

乳腺癌是女性發生率最高的惡性腫瘤，在我國其病死率呈逐年上升趨勢，僅次于肺癌，占女性惡性腫瘤第二位[1-2]。乳腺癌有多種亞型[3]，其中三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）均為陰性的一種特殊類型的乳腺癌，占乳腺癌的15%～20%[4]，缺乏有效的靶向治療手段，預后較差，死亡率較高。

表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）是HER/ErbB家族成員，定位于細胞膜上[5]，在許多惡性腫瘤中異常高表達。有研究報道，腫瘤細胞內EGFR通過形成二聚體激活酪氨酸蛋白激酶并誘導下游蛋白磷酸化，從而啟動下游信號通路，促進并調控腫瘤細胞增殖、血管生成、腫瘤轉移[6]。EGFR在TNBC中的表達水平比其他亞型乳腺癌高，目前被認為是TNBC防治的重要腫瘤靶點[7]。

近年來細胞原位單分子成像研究領域是交叉學科的研究熱點之一。2006年莊小威等[8]報道了基于單分子熒光檢測的超高分辨率成像方法，即隨機光學重建顯微法（STORM），基于光化學機制在實驗室合成了超亮的可光控的染料及具有最佳性能的熒光蛋白。在此基礎上也發展了高分辨熒光成像，發展了單分子超高分辨率的方法。2015，Peckys等利用量子點對乳腺癌細胞表面的HER2進行單分子研究，為單分子成像提供了豐富的理論依據[9]。

相比較于光學顯微鏡，電鏡用電子束作為激發光源，不受衍射極限的限制，具有納米級的分辨率。在此，我們利用EGFR特異的核酸適配體介導鏈接納米金顆粒，用環境掃描電子顯微鏡觀察研究了三陰性乳腺癌細胞的二次電子像，利用電子顯微鏡的超分辨率在納米尺度對EGFR在該細胞表面的分布及聚集狀態進行了成像分析研究。本研究為深入探討EGFR作用機制和開發評價相應靶向藥物提供了新的可視化研究手段，也為腫瘤防治提供了新的技術思路。

1 材料與方法

1.1 材料

三陰性乳腺癌細胞MB-231細胞系購于美國模式培養物集存庫（ATCC）；鏈霉親和素修飾的納米金顆粒由NANOCS公司合成；特異性結合EGFR的核酸適配體序列TGCCGTTTCTTCTCTTT CGCTTTTTTTGCTTTTGAGCATG[10]由生工生物工程股份有限公司合成；ITO導電玻璃購于上海聚笛玻璃公司。

1.2 MB-231細胞培養

在生物安全柜中將ITO導電玻璃置于75%酒精中浸泡30 min，紫外燈下照射30 min，放入12孔板中。將2×105/mL的MB-231細胞懸液鋪在有ITO導電玻璃的12孔板中，培養24 h后，加入1 mL 4%多聚甲醛固定細胞30 min，用超純水清洗培養有MB-231細胞的ITO導電玻璃5次，晾干后將濃度為20 mol/L的生物素標記的EGFR適配體室溫敷育在ITO導電玻璃上，于濕盒中敷育1 h，用超純水清洗干凈，晾干后將鏈霉親和素標記的金顆粒用超純水稀釋至1/10，滴在細胞上，放入濕盒中敷育1 h，用超純水清洗ITO導電玻璃10次后晾干。

1.3 掃描電鏡表征

采用FEI公司Quanta 600環境掃描電鏡（environmental scanning electron microscope，ESEM）。ESEM成像模式[11]主要有二次電子（secondary electron，SE）像、背散射電子（backscattered electron，BSE）像。二次電子信號主要來自樣品表層5～10 nm深度[12]，能量較低（小于50 eV），二次電子像具有分辨率高、景深大、立體感強的特點，主要分析來自樣品表面的信息。背散射電子是被固體樣品中的原子核反彈回來的一部分入射電子，能量很高，有相當部分接近入射電子能量。背散射電子像主要反映原子序數襯度。真空度模式有高真空、低真空、環境真空等3種模式，相應樣品室壓力為10-2～10-5、13～133、133～2600 Pa。入射電子束輻照能量2～30 keV可調，入射電流10-8～10-9A，大倍數20～200 000′連續調節。

1.4 統計分析

利用imageJ軟件，隨機選擇細胞不同位置的照片5張，分析統計蛋白表達數目，量化蛋白點，計算單體、二聚體、多聚體分布數目及比值，分析其分布特點。

2 結果

2.1 MB-231細胞在掃描電鏡下成像

MB-231細胞以單層細胞狀態貼壁生長在ITO導電玻璃上，呈貼壁的梭型或橢圓形，掃描電鏡表征，可以清晰地看到MB-231細胞的形態。圖1為三陰性乳腺癌細胞MB-231細胞在200 μm尺度下的二次電子像（BSE像），加速電壓為10 kV，spot size為3，可以清晰地看到細胞之間的胞間連絲。細胞生長狀態良好，可用于后續的高分辨成像研究。

2.2 MB-231細胞表面標定EGFR單分子成像觀察

利用環境掃描電子顯微鏡對標記金顆粒的三陰性乳腺癌細胞進行觀察。由于每個EGFR分子僅結合1個金顆粒，因此1個金顆粒代表1個EGFR單分子。圖2為三陰性乳腺癌細胞表面EGFR的掃描電鏡成像圖片?？梢郧逦赜^察到EGFR既可以單分子狀態存在，亦可以二聚體或多聚體（EGFR分子個數≥3）的形式存在。當2個或多個EGFR分子間距離小于15 nm時，我們認為其形成了二聚體或多聚體[13]。成像結果顯示無論是EGFR單體還是二聚體或多聚體，均隨機地分布在三陰性乳腺癌細胞表面，沒有發現某個區域以單分子為主或某個區域以二聚體或多聚體為主的現象。由于缺乏單分子的超分辨率研究手段，目前有關EGFR的報道更多集中在其可形成二聚體上面，但對其多聚體現象卻鮮見報道。從我們利用電鏡實現單分子納米尺度下的超分辨成像的統計結果來看，常規培養條件下EGFR單體在三陰性乳腺癌細胞表面所占比例為36.98%，二聚體比例為12.22%，而多聚體比例高達50.80%。該結果提示EGFR在三陰性乳腺癌細胞表面主要以二聚體和多聚體的形式存在，而非單體形式，EGFR二聚體和多聚體比例總和達62%以上。如果EGFR僅簡單聚集成為二聚體即可激活其下游的信號轉導通路并促進細胞的增殖、遷移和抗凋亡的話，我們的結果顯示在三陰性乳腺癌細胞表面大于62%的EGFR分子是處于激活狀態并調控細胞的生長、遷移等基本功能。

3 討論

EGFR是相對分子質量為170 000的跨膜受體酪氨酸激酶。目前研究認為表皮細胞生長因子（epithelial growth factor，EGF）或轉化生長因子α（transforming growth factor-α，TGF-α）與 EGFR結合后，可以促使EGFR發生二聚體化，并通過改變其構象誘導自身的酪氨酸殘基發生磷酸化，磷酸化的EGFR形成并暴露Grb2結合位點并與Grb2分子結合，Grb2分子通過2個SH3結構域與SOS的鳥苷酸交換因子結合并進一步活化Ras，激活Ras、MAPK和ERK等分子，最后ERK可轉移到細胞核內參與調控細胞生長遷移等功能。因此，單分子的EGFR處于一種沒有酪氨酸激酶活性的狀態，且不具有啟動調控或下游信號轉導途徑的功能。EGFR形成二聚體后可通過自身磷酸化啟動下游信號通路并調控細胞狀態。本研究結果表明包括二聚體在內的EGFR多聚體占其總數的比例超過了62%，這可以理解為在三陰性乳腺癌細胞表面絕大多數EGFR是處于聚體的激活狀態。本研究結果與EGFR信號通路在腫瘤細胞中異常活躍，抗EGFR的小分子藥物或抗體藥物具有較好的抗腫瘤活性的結果相符。

圖1 三陰性乳腺癌細胞MB-231的掃描電鏡成像

圖2 EGFR標定金顆粒在掃描電鏡下成像

EGFR多聚體現象在有關EGFR的研究中鮮見報道，本研究發現EGFR二聚體比例在TNBC表面僅為12%左右，而其多聚體比例可達50.80%，說明超過50%的EGFR在TNBC表面以多聚體的形式存在。EGFR多聚體與二聚體在調控細胞的作用和功能上是否有區別及有何區別目前還未知。綜上，我們利用電鏡在納米尺度上定量分析了EGFR在TNBC表面的分布及聚集狀態，為進一步在納米尺度的單分子水平全面揭示EGFR信號通路的調控機制及功能，研發高效的調控EGFR通路的抗腫瘤藥物提供了新的研究手段和策略。