ATP生物發光法檢測噴氣燃料中真菌的污染程度

李澤振，熊云，陳波

1.中國人民解放軍陸軍勤務學院 油料系，重慶 401331；

2.駐中國石油化工股份有限公司鎮海煉化分公司軍代室，浙江 寧波 315207

自20世紀30年代以來，已有許多關于噴氣燃料微生物污染的研究報道[1]。微生物的存在可能導致飛機燃油過濾器堵塞[2]、發動機損壞[3]、油量表故障及儲油設備腐蝕[4]等問題。因噴氣燃料儲存地點及使用條件[5]的不同，其中的微生物類型也存在差異。真菌作為噴氣燃料中的主要污染微生物[6]，亦是噴氣燃料懸浮物問題的重要原因[7]，一直以來都是噴氣燃料微生物污染領域的研究重點。Ferrari等分析了350份噴氣燃料樣本，發現主要污染真菌是枝孢霉菌及曲霉菌[8]。楊浩等通過對我國不同地區的噴氣燃料油樣進行微生物富集及測序分析，認為噴氣燃料中的主要污染真菌為枝孢霉菌、青霉菌及曲霉菌等[9]。

ATP普遍存在于所有活的生物體中，被用來貯存和傳遞化學能[10]。通過測定樣品中的ATP含量，即可間接推算出樣品中的微生物數量。ATP生物發光法是一項通過檢測整個反應過程中的熒光強度來衡量ATP含量的技術。McElroy最先引入螢光素酶-ATP檢測法，其反應機理為：在Mg2+存在下，螢火蟲螢光素酶以ATP、O2為底物，將化學能轉化為光能，發出光量子，其發光強度與ATP濃度成正比，因此可通過測定發光強度來定量ATP濃度[11]。

目前對噴氣燃料微生物的研究主要集中在污染菌種的鑒定及治理措施方面[12]，噴氣燃料微生物污染程度的檢測主要通過傳統平板計數法，而平板計數法存在耗時久、操作復雜等缺點，因此建立一種能快速檢測燃料中真菌污染程度的方法是有意義的。ATP生物發光法通過測量反應體系的熒光強度來分析從微生物中提取得到的ATP數量，并間接反應微生物數量，整個檢測過程可在數分鐘內完成。目前，ATP生物發光法已廣泛用于食品衛生和環境監控等方面[13]，而在噴氣燃料中微生物污染程度方面的研究還很少。我們研究了噴氣燃料主要污染真菌的最佳ATP提取方法及熒光素-螢光素酶反應體系的篩選，初步建立了噴氣燃料真菌污染程度的檢測方法，并與傳統平板計數法相比較，在一定范圍內可以代替平板計數法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株枝孢霉菌（Amorphotheca resinae）、帚狀曲霉（Aspergillus penicillioides）、局限青霉（Penicilliμm restrictum）均為實驗室保藏菌種，由污染噴氣燃料中分離鑒定得到。試驗用油為3號軍用噴氣燃料，由中國石油化工股份有限公司鎮海煉化分公司提供。

沙保培養基（葡萄糖4 g，蛋白胨1 g，瓊脂粉1.5 g溶于100 mL蒸餾水，121℃滅菌20 min）自制；CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、BAB（苯扎溴銨）、BAC（苯扎氯銨）、SDS（十二烷基硫酸鈉）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；標準ATP試劑購于上海普洛麥格生物產品有限公司；3種熒光素-螢光素酶試劑分別購于國內3家公司。

單功能光吸收酶標儀VersaMax（美國Molecular Devices Corporation）；HY-LiTE Jet A1 Fuel Test（德國Merck公司）；Tomy SX快速自動高壓滅菌器（日本Tomy Digital Biology公司）；ESCO OptiMair垂直流超凈工作臺（新加坡藝思高科技有限公司）；SPX-150培養箱（北京厚慧實驗儀器有限公司）。

1.2 熒光素-螢光素酶體系的篩選

用ATP緩沖液將標準ATP試劑（10-2mol/L）分別稀釋至 10-8、3×10-9、10-9、3×10-10、10-10、3×10-11mol/L，取各濃度ATP溶液50 μL分別加入100 μL 3種不同的熒光素-螢光素酶體系中，測定發光值，重復3次取平均值。

1.3 模擬污染噴氣燃料

取在沙保培養基中培養2 d后的3種試驗真菌菌液各5 mL，分別加入500 mL提前用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾后的噴氣燃料中，振蕩混勻后靜置3 d，作為3種真菌的模擬污染噴氣燃料。另取培養好的3種試驗真菌菌液各2 mL，同時加入500 mL過濾后的噴氣燃料中，振蕩混勻后靜置3 d，作為混合菌的模擬污染噴氣燃料。

1.4 ATP裂解液的篩選

用自制提取液分別富集3種真菌的模擬污染噴氣燃料中的微生物，得到待測樣品。各取1 mL待測樣品分別加入1 mL 0.1%的BAC、BAB、CTAB及SDS溶液中，振蕩混勻后室溫作用1 min，取50 μL反應液加入 100 μL 篩選出的熒光素-螢光素酶反應體系中，測量發光值，以無菌水作為空白對照。每組試驗重復3次，取均值。

1.5 BAC最佳裂解濃度確定

配置濃度分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%及0.25%的BAC裂解液，取3種真菌的模擬污染噴氣燃料提取后的待測樣品各1 mL，分別加入1 mL不同濃度的BAC溶液中，輕微振蕩混勻后于室溫作用 1 min，取 50 μL 反應液加入 100 μL 熒光素-螢光素酶體系中，測量發光值。

1.6 BAC最佳裂解時間確定

取3種真菌的模擬污染噴氣燃料提取后的待測樣品各1 mL，分別加入1 mL 0.15%的BAC溶液中，輕微振蕩混勻后分別于室溫作用0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 min，之后分別取 50 μL反應液加入100 μL熒光素-螢光素酶體系中，測量發光值。

1.7 ATP生物發光法與平板計數法的相關性

試驗真菌分別接入沙保斜面培養基，26℃培養7 d后加入5 mL無菌水，輕輕刮下斜面上的孢子，振蕩過濾后得到孢子懸浮液，以血球板計數后4℃保存。用無菌水將真菌孢子懸浮液稀釋至不同梯度，分別用傳統平板計數法及ATP生物發光法檢測，分析2種方法的相關性。

1.8 ATP生物發光法檢測污染噴氣燃料

平行培養1.3中的3種真菌及混合菌的模擬污染噴氣燃料，每種各5組，并以無菌水代替菌液加入噴氣燃料中作為空白對照。首先用自制提取液提取微生物得到待測樣品，分別取1 mL待測樣品加入1 mL 0.15%的BAC中作用30 s后，立即取50 μL反應液加入100 μL熒光素-螢光素酶體系中，測量發光值。每組試驗重復3次，取均值，并通過測定各平行組的熒光值考察方法的重復性。

2 結果與討論

2.1 熒光素-螢光素酶體系的篩選結果

熒光素-螢光素酶體系的篩選結果如圖1所示。3種熒光體系中的C型熒光素-螢光素酶體系比A型相關性高，比B型線性范圍廣。通過回歸分析，得出C型一元線性方程為y=0.8080x+8.3884（R2=0.9654），即當 ATP 濃度為 10-8～3×10-11mol/L時，熒光強度與ATP濃度有良好的線性關系，最終確定C型熒光素-螢光素酶體系。在實際使用情況下，因噴氣燃料中的微生物數量較少，而在富集微生物和ATP釋放過程中會有損耗，且存在人工操作和儀器檢測的誤差，所以需要更為靈敏穩定且檢測限更低的熒光素-螢光素酶發光體系。

2.2 ATP裂解液篩選結果

各ATP裂解液對試驗真菌的作用如表1所示。BAB、BAC及CTAB這3種表面活性劑裂解液效果較好，均能顯著提高熒光強度，其中BAC效果最好且毒性更低，使用方便，是ATP裂解液的良好選擇。

2.3 BAC最佳作用濃度確定

BAC的作用濃度篩選結果如圖2A所示，可以看出3種試驗真菌的熒光強度隨BAC濃度的提高均是先增大后減小，當BAC濃度為0.15%時熒光強度最大。這可能是因為適量濃度的BAC可以增加ATP的釋放效率，但過量的BAC會抑制螢光素酶的活性，導致熒光強度降低。確定BAC的最佳作用濃度為0.15%。

圖1 3種熒光素-螢光素酶體系的ATP濃度與發光強度關系

2.4 BAC最佳作用時間確定

BAC的時間篩選結果如圖2B所示，隨著裂解時間的增長，3種試驗真菌的熒光強度快速降低，這一方面是由熒光體系與ATP的反應過程決定的，另一方面可能是因為螢光素酶的穩定性不高而造成的。為了得到最大的熒光強度，確定BAC的最佳作用時間為30 s。

2.5 ATP生物發光法與傳統平板計數法的相關性

將3種試驗真菌的孢子懸液稀釋至不同濃度梯度，分別采用ATP生物發光法及平板計數法計量其數量，結果如圖3所示。在試驗范圍內，3種真菌的試驗結果均線性相關，相關系數均在0.96以上，說明用ATP生物發光法檢測真菌數量與傳統平板計數法有良好的相關性。在實際應用中，因為噴氣燃料中的污染菌種復雜多樣，直接將熒光結果對應菌落總數是困難的，而熒光結果可以反應微生物數量，間接表征污染程度。

2.6 ATP生物發光法檢測污染噴氣燃料

用ATP生物發光法對5組平行培養的模擬污染噴氣燃料的檢測結果如表2。在各組的3次重復試驗中，變異系數CV均小于3%，而各平行組的變異系數如表2所示，可見本方法對同一樣本的檢測重復性要高于平行組。推測是因為真菌的生長特性，難以確保各平行組內的真菌數量一致，而混合菌的生長情況更為復雜，所以其變異系數最高。在實際應用本方法時，因為噴氣燃料中微生物生長情況復雜，難以將熒光結果對應菌落數，所以可以直接利用熒光強度的大小來區分不同的污染程度。

表1 不同裂解液的ATP裂解效果

表2 ATP生物發光法測量結果

圖2 BAC作用濃度（A）和作用時間（B）對熒光強度的影響

圖3 3種試驗真菌的數量與熒光強度的關系

2.7 結論

篩選了國內A、B、C共3種熒光素-螢光素酶發光體系，結果表明C產品在10-8～3×10-11mol/L范圍內，熒光強度與ATP濃度有良好的線性關系，其檢測限可達10-15mol ATP，可以用來檢測噴氣燃料中的真菌的污染程度。

對4種常用的真菌ATP裂解液進行了篩選，并進一步研究了最佳作用濃度及時間，結果表明0.15%的BAC作用30 s后可明顯提高熒光強度。

用ATP生物發光法及傳統平板培養法對試驗真菌的數量進行檢測，結果表明2種方法有較好的關聯性，在一定范圍內，可以用ATP生物發光法檢測噴氣燃料中的真菌污染程度。

利用ATP生物發光法檢測噴氣燃料中真菌污染程度具有耗時短、操作簡單且不需要大型儀器的優點，可以確保現場快速檢測。但在現階段還面臨重復性低、檢測限高等問題。但其作為一種初步檢測方法，可以快速判定噴氣燃料中是否存在微生物污染情況及污染的嚴重程度，如果出現污染情況，可以對污染油料作后續檢測及治理，避免事故發生。