晚期結(jié)直腸癌腫瘤的循環(huán)細(xì)胞檢測及臨床意義

雷 蕾 葉 斌

（成都市第六人民醫(yī)院腫瘤科，四川 成都 610051）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤，我國的發(fā)病率和病死率呈逐年升高的趨勢，有20%～45%的患者在術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）是指實體瘤患者外周血存在的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的必要條件。檢測CTC有助于判斷患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險及預(yù)后，指導(dǎo)治療手段的選擇[2]。本研究檢測2015年6月至2017年2月晚期結(jié)直腸癌患者45例，同期入組體檢健康人45例作為對照組，具體分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2015年6月至2017年2月晚期結(jié)直腸癌患者45例，同期體檢健康人45例，分為觀察組；男26例，女19例，年齡54～79歲，平均（66.2±11.5）歲，對照組：男22例，女23例，年齡52～78歲，平均（67.1±10.8）歲。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集：采集7.5 mL的腫瘤患者外周靜脈血，肝素抗凝。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞的富集：用PBS按1∶1的比例等倍稀釋全血，轉(zhuǎn)移至離心管定容至50 mL，室溫800 g離心15 min，棄上清，輕吸出單核層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管，加入20 mLPBS混勻，4 ℃ 300 g離心15 min后去上清ā加入200 μL PBS溶液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，將捕獲抗體（Ep CAM）混入，在18～20 ℃下孵育1 h后，加入800 μL PBS混勻，300 g離心5 min，洗滌2次，棄上清液，加入200 μL PBS重懸細(xì)胞ā取濾液，泵入修飾過的芯片以流速200 μL/h進(jìn)行細(xì)胞分離，1 h后拆下芯片置于平皿進(jìn)行檢測。

1.2.3 CTC的免疫染色鑒定：芯片室溫干燥，加入2%多聚甲醛固定15 min后去除固定劑，加入透膜劑，處理15 min后加入一抗混合液（CK，CD45），于4 ℃避光過夜孵育。次日用7～8 mL PBS分三次泡洗，混入二抗混合液（Alexa488 和Alexa 555），室溫避光孵育40 min后加入，染核試劑（DAPI）20 min。再次用PBS泡洗3次，室溫晾干后鏡下觀察。

1.2.4 CTC陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：CK＋（Alexa488）/CD45-（Alexa555）/nuclear＋（hochest33342）的細(xì)胞判斷為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料用（-x±s）表示，計數(shù)資料比較進(jìn)行χ2檢驗，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌及對照組循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測結(jié)果：對照組均未查到CTC（-），檢出率為0%（0/45），觀察組檢測出CTC21例，占46.7%（21/45），兩組患者的CTC檢測陽性率相差顯著（P＜0.05），見表1。

表1 CTC的表達(dá)情況與患者臨床特征的關(guān)系

2.2 化后對CTC陽性率的影響：化療前后CTC陽性率具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），見表2。

表2 化療前后患者CTC陽性率比較

3 討 論

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）指從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落下來的細(xì)胞[3]，通過血管或淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液，形成微小癌栓，最后發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[4]。CTC操作簡便，標(biāo)本易得，具有腫瘤的特征。多項研究表明 CTCs 的數(shù)量與 CRC 患者的預(yù)后關(guān)系密切[5]。Rahhari等[6]的Meta分析結(jié)果顯示CTC不受年齡ā性別ā腫瘤病灶的分化程度等因素的影響，但與患者病理分期相關(guān)，可以作為患者預(yù)后和臨床評價的標(biāo)志物。

腫瘤患者的治療一般由腫瘤的分期、病理分化及預(yù)后等因素來決定，但目前評估療效評價的手段有限，不能及時發(fā)現(xiàn)腫瘤的早期轉(zhuǎn)移。Ⅱ期臨床研究表明，術(shù)后或化療前CTC的檢出是乳腺癌患者早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)[7]。治療前后CTC數(shù)目的變化可以提示治療效果的反應(yīng)。ARBAZAN等用組合生物標(biāo)記鑒定mCRC的CTC，發(fā)現(xiàn)患者治療過程中CTC較CT更早出現(xiàn)變化，預(yù)后也較差。研究表明，CTC分子標(biāo)記可以檢測耐藥基因的表達(dá)，有助于判斷腫瘤患者疾病發(fā)展，評估和監(jiān)測治療效果，指導(dǎo)調(diào)整用藥。本研究中，化療觀察組CTC陽性率顯著降低（P＜0.05），與療效存在負(fù)相關(guān)性，與之前報道結(jié)果一致。在治療階段，動態(tài)評估 CTCs 可以指導(dǎo)臨床治療方案的改進(jìn)，減少不必要的藥物毒性，給低風(fēng)險的患者合理安排治療間歇。

綜上，檢測CTC的數(shù)目變化可提示患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的變化趨勢，是患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素，也可以作為檢測治療方案是否有效的重要指標(biāo)。建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方案和評價標(biāo)準(zhǔn)仍有待于后續(xù)大規(guī)模臨床研究。因此動態(tài)檢測患者治療前后CTCs的變化，可以作為一種新型診斷工具，具有重要的臨床意義。