大陵穴對大鼠踝部損傷成纖維細胞修復的影響※

涂國卿 鄒來勇 曹耀興 朱玉輝 李 豐

（江西中醫藥高等專科學校附屬醫院針灸科，江西 撫州 344000）

踝關節扭挫傷是臨床常見病、多發病，導致患部疼痛、瘀腫及功能障礙等，嚴重影響患者的生活質量。目前臨床治療方法多為中草藥外敷，很少有針刺治療者[1]。本研究通過平衡針刺大陵穴，分析平衡針刺大陵對踝部軟組織損傷修復的影響，探索軟組織損傷修復與成纖維細胞這一關鍵的細胞信號通路的具體關系，為臨床應用提供實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組及造模 93只體質量為 (200±10)g的清潔級Wistar種大鼠，在相同條件下單籠適應性喂養半月后。用10%硫化鈉溶液脫除大鼠左后腿踝部鼠毛，用自制撞擊器 (質量120 g)，固定高度，撞擊接觸面（直徑0.4 cm），在大鼠左后腿踝部外側連續打擊4次，造成局部軟組織損傷模型。造模成功后將大鼠隨機分為空白對照組、常規針刺組及平衡針刺組，每組31只。

1.2 動物干預方法

1.2.1 空白對照組 不進行針刺，常規喂養及觀察。

1.2.2 常規針刺組 選取病變部位昆侖、丘墟、解溪、太溪。常規酒精棉球消毒，采用提插針刺手法，直刺0.2～0.3寸，留針15 min。

1.2.3 平衡針刺組 穴位定位參照李忠仁主編的《實驗針灸學》“常用實驗動物針灸穴位”，大陵穴：腕關節內側橫紋中心，橈側腕屈肌腱與指淺屈肌腱之間。根據“病在左，取之右”及突出單穴療法之原則，都取右側大陵穴。選用13 mm 0.5寸一次性毫針，常規酒精棉球消毒，采用提插針刺手法，直刺0.2～0.3寸，以大鼠出現劇烈的抽搐樣表現為宜，快速針刺，快速出針不留針。

以上3組，每天治療1次，連續治療21 d。實驗過程中，每天觀察傷肢腫脹和瘀斑等癥侯。

1.3 組織學檢查 組織學觀察評分標準：6分：軟組織同正常組織；4分：肌纖維腫脹，肌組織內瘀血、水腫、出血灶明顯減輕或大部分消失，血管增生，膠原纖維增生，已基本恢復正常；2分：肌纖維腫脹伴有變性，肌組織內瘀血、水腫、出血灶稍有減輕或部分消失，纖維母細胞侵入，血管增生或膠原纖維增生，與對照組相比較略有減輕；0分：肌纖維腫脹伴有透明樣變性，肌纖維明顯壞死，肌纖維組織內伴有嚴重瘀血、水腫、出血。

1.4 成纖維細胞免疫組織化學檢測 于術后21 d處死大鼠，并取損傷處瘢痕的軟組織，體積分數為4%的甲醛固定，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，將蠟塊標木切成5 μm厚的石蠟切片，對石蠟切片脫蠟后行蘇木精-伊紅染色，并在光鏡下進行組織形態學觀察。

免疫組織化學檢測:采用鏈霉親和素-過氧化酶連接法 (SP法)檢測增殖細胞核抗原。二甲苯脫蠟，乙醇逐級 (體積分數為100%→體積分數為95%→體積分數為80%→體積分數為70%)至自然水化，蒸餾水洗；采用0.01 mol/L構椽酸鈉緩沖溶液，高溫高壓修復抗原；蒸餾水洗，PBS 5 min沖洗3次；體積分數為3%的H202阻斷內源性過氧化物酶10 min，PBS 5 min沖洗3次；滴加適當比例稀釋的增殖細胞核抗原單克隆抗體，4℃過夜；PBS 5 min沖洗3次，滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育40 min；PBS 5 min沖洗3次，DAB顯色液；蘇木精液復染細胞核1 min，體積分數為95%、體積分數為100%的乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。每批染片均有已知陽性同一蠟塊作陽性對照，及PBS為一抗做陰性對照。細胞核呈黃色或棕黃色者為陽性。在顯微鏡下每張切片隨機選擇5個視野 (每個視野中至少200個細胞)，計數增殖細胞和正常細胞數目，按公式：增殖指數 (%)=增殖細胞數/總細胞數×100%計算增殖細胞占總細胞數的比例，并計算出平均增殖指數。

1.5 統計學方法 數據處理采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料用平均值±標準差 （±s）表示，結果以P<0.05為差異顯著的標準。

2 結果

2.1 組織學觀察評分 結果顯示：治療前各組評分比較無明顯差異（P>0.05）；治療前后各組比較，平衡針刺組有顯著性差異（P<0.01），常規針刺組有顯著性差異（P<0.05），空白對照組沒有顯著性差異（P>0.05）；治療后各組比較，平衡針刺組與常規針刺組及空白對照組比較都有顯著性差異（P<0.01），常規針刺組與空白對照組無顯著性差異（P>0.05） （見表1）。

表1 3組治療前后組織學評分 （±s，分）

表1 3組治療前后組織學評分 （±s，分）

注：治療前各組比較，1）P>0.05。治療前后各組比較，平衡針刺組，2）P<0.01；常規針刺組，3）P<0.05；空白對照組，4）P>0.05。治療后各組比較，平衡針刺組與常規針刺組及空白對照組，5）P<0.01；常規針刺組與空白對照組，6）P>0.05

組別 只數 治療前 治療后平衡針刺組 31 0.50±0.061) 3.2±0.32）5）常規針刺組 31 0.52±0.03 0.7±0.43）6）空白對照組 31 0.51±0.05 0.61±0.34）

2.2 組織形態學觀察 伊紅染色結果顯示，平衡針刺組治療組成纖維細胞形態規則，呈梭形，其細胞核為卵圓形，位于細胞中央，數量多。免疫細胞化學結果顯示，成纖維細胞表達為陽性；常規針刺組成纖維細胞形態較規則，呈梭形，其細胞核為卵圓形，位于細胞中央，數量一般，成纖維細胞表達為陽性；空白對照組成纖維細胞形態不規則，其細胞核為卵圓形，位于細胞一側，數量較少，成纖維細胞表達為弱陽性。

2.3 成纖維細胞增殖指數 0～6 d各組增殖較緩慢，3組細胞的生長曲線均呈平緩上升趨勢；7～9 d細胞的增殖速度加快，從9 d開始平衡針刺組 (系列1）的增殖速度明顯高于常規針刺組（系列2）與空白對照組（系列3），第21天，3組增殖速度達到峰值，平衡針刺組的增殖速度明顯高于其他2組。見圖1。

圖1 成纖維細胞增殖指數

3 討論

踝關節扭傷屬中醫學“筋痹”“痹癥”范疇，是由于外傷因素，使踝部的經脈受損，氣血運行不暢，經絡不通，氣滯血瘀而致[2]。制定便捷、合理、高效的治療方案是未來的研究趨勢，最大限度恢復運動功能、降低并發癥發生率是未來研究的最終目標[3]。其主要表現為踝關節腫脹、疼痛，局部瘀斑和功能障礙等，如處理不及時或不當，常常遺留踝關節不穩及后期創傷性關節炎。針刺治療軟組織損傷可提高痛閾，減輕局部炎癥反應，促進組織修復，從而起到緩解疼痛、減輕腫脹的作用[4-5]。目前有腧穴與腦功能特定聯系、針灸鎮痛機制[6]等方面相關研究的報道。

根據《靈樞·官針》：“巨刺者，左取右，右取左”，《靈樞·終始》：“病在下者，高取之”，故獨取健側大陵穴。大陵穴，是臨床上常用的特定穴，屬手厥陰心包經，為手厥陰心包經之輸穴、原穴。大陵穴位于腕掌側橫紋頭之中點，橈側腕屈肌腱與掌長肌之間的凹陷處，為手厥陰心包經之原穴，因其在五輸穴中為輸穴，屬土，據其“輸”主體重節痛的理論，此穴還具有理氣止痛、舒筋活絡、祛風止痹的作用。大陵是心包經的輸穴、原穴，與三焦經相表里，在王文遠教授的平衡穴位里稱為踝痛穴，能治療小腿、踝關節及足底疼痛等病變；在名醫李柏松先生的“八字治療法”中大陵穴為治療踝關節疼痛的反應點。在治療方面臨床取用原穴能使三焦原氣通達，從而激發原氣，調動體內的正氣以抗御病邪，有研究[7]認為針刺大陵穴能促進血管舒張，故巨刺大陵穴可行氣活血、化瘀通絡、消腫止痛。研究表明[8]：針刺大陵穴則可能更傾向于對自主神經及客觀語言等非主觀因素產生影響。

“平衡針刺法”是在繼承傳統醫學的基礎上，吸收現代科學理論而發展起來的一門現代針灸學。平衡針刺采取遠距離取穴，即“病在上，取之下；病在下，取之上；病在左，取之右；病在右，取之左”；突出單穴療法，原則上是一病一穴，一癥一穴；突出快速針刺亦稱三快針法，即進針快、找針感快、出針快，整個針刺過程控制在3 s之內；突出即時效應亦稱一針見效。平衡針刺具有取穴少、療效好、安全價廉，突出安全、突出有效、突出簡便、價格低廉等特點，充分地發揮了機體自身調節平衡的獨立性，同時產生異向思維，采用頭痛醫腳，腳痛醫手的平衡取穴方法。涂國卿[9]采用“整體平衡療法” (平衡針刺法加平衡推拿法)治療腰椎間盤突出癥，并與常規針刺和推拿方法對比，觀察兩者鎮痛效果與鎮痛時效，表明“整體平衡療法”對比傳統針刺和推拿療法治療腰椎間盤突出癥具有更好的鎮痛效果，體現了中醫整體觀的優越性。韓笑[10]采取平衡針腰痛穴對比傳統針刺治療腰椎間盤突出癥，結果：2組治療后比較，疼痛改善率及疼痛分級指數總分、視覺模擬量表評分、現時疼痛狀況，平衡針組略顯優勢，既體現在即時效果，也表現在遠期療效方面 (P<0.05)。結論：平衡針能很好地改善腰椎間盤突出癥的疼痛癥狀，既有即時效果，也有遠期療效。

成纖維細胞 (fibroblast，FB)是主要的軟組織損傷修復細胞，它是高度異型的間充質細胞，是疏松結締組織的主要細胞成分，細胞呈梭形或扁的星狀，具有突起，也是致密結締組織如肌腱、韌帶分泌膠原的主要細胞。成纖維細胞可以分泌多種生長因子 (如TGF-b， PDGF， bFGF)、激素 (如IGF-I，IGF-II)及細胞素(如IL-1，TNF-a）。成纖維細胞能夠維持各種生長因子、細胞素、基質金屬蛋白酶及金屬蛋白酶組織抑制因子的合成與分解平衡。因此Lekic等[11]認為，它是創傷修復的工程師、建筑者和管理員。了解與控制FB的生物學行為是促進軟組織損傷修復、創傷愈合、預防瘢痕形成的基礎與關鍵[12]。FB在軟組織損傷修復過程中的作用是極為重要的。它的增殖及凋亡將影響著各種生長因子及基質的合成及釋放，影響著肉芽組織及瘢痕粘連的形成。在組織損傷修復的不同時期，FB的增殖與凋亡都有不同的意義[13]。關于FB對軟組織損傷修復中作用的研究日益深入，但人多數是關于皮膚創傷修復的研究，從FB對肌肉、肌腿、韌帶、筋膜等組織的損傷修復角度研究的卻不多，但FB在這些組織損傷中的修復過程及機制是基本一致的。

本研究顯示：治療前后各組組織學評分比較，平衡針刺組有顯著性差異，常規針刺組有顯著性差異，空白對照組沒有顯著性差異；治療后各組比較，平衡針刺組與常規針刺組及空白對照組比較都有顯著性差異；平衡針刺組治療組成纖維細胞形態規則，呈梭形，其細胞核為卵圓形，位于細胞中央，數量最多。成纖維細胞表達為陽性，治療結束后3組成纖維細胞增殖速度達到峰值，平衡針刺組的增殖速度明顯高于其他2組。說明平衡針刺能較好地調節成纖維細胞的表達，增加其數量，能更好地修復損失組織，達到較好的治療效果。