新生兒科分離白假絲酵母菌多位點序列分型研究

王雙杰，黃海鋒，佘尚揚，岑貞嬌，曾尚娟，阮佳玲，余 夏

(1 廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院, 廣西 南寧 530021； 2 廣西南寧市第二人民醫(yī)院, 廣西 南寧 530031)

白假絲酵母菌是一種侵襲性條件致病菌，可引起體表及機體深部多個部位感染。白假絲酵母菌深部感染可侵犯肺、腸道，嚴重時甚至入血引起敗血癥，導(dǎo)致患者死亡，具有感染率高、病死率高等特點，因此，白假絲酵母菌已經(jīng)成為引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一[1-3]。有報道[4-5]指出白假絲酵母菌引起的血流感染具有明顯的地區(qū)差異和科室聚集性特征。醫(yī)院新生兒科病房收治的主要為免疫功能不全的危重新生兒，這些患兒使用廣譜抗菌藥物、接受侵入性診療操作均較多，是發(fā)生白假絲酵母菌血流感染的高危人群。

白假絲酵母菌既可以是患者體內(nèi)的定植菌株，也可以通過醫(yī)院內(nèi)傳播而獲得。分子生物學分析法聯(lián)合流行病學調(diào)查及基因分型可以區(qū)分社區(qū)感染和醫(yī)院感染[6]。目前，運用較多的分子生物學分析方法包括：(1)基于電泳圖譜分析的分型方法，如脈沖場凝膠電泳(PFGE)；(2)以核苷酸序列為基礎(chǔ)的分型方法，如多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)。PFGE方法曾被廣泛用于白假絲酵母菌及其他假絲酵母菌分型；但是，PFGE方法耗時長，操作步驟較為復(fù)雜，易受緩沖液的種類、濃度、溫度及電泳時脈沖角度、時間、電壓梯度的影響，區(qū)分分子量相近的DNA較為困難，不同實驗室之間的數(shù)據(jù)不能進行對比，這些原因限制了PFGE方法的應(yīng)用[7-9]。MLST方法結(jié)合了高通量測序與群體遺傳學的生物信息技術(shù)，操作相對簡單，可以通過公共網(wǎng)絡(luò)進行分析比對，具有較高的鑒別力和可操作性，可用于病原菌和耐藥菌株的溯源追蹤，反映菌株的生物進化學關(guān)系[10]。

目前，國內(nèi)一些白假絲酵母菌流行病學研究報道顯示，白假絲酵母菌MLST主要根據(jù)7個管家基因(housekeeping gene)片段進行，每個管家基因幾乎都有保守性，但不同種或菌株間存在一定差異[5-6, 10-12]。根據(jù)MLST方法對新生兒科病房分離的白假絲酵母菌進行分子生物學分型，對于醫(yī)院感染監(jiān)控和流行病學調(diào)查有重要意義。目前，國內(nèi)針對醫(yī)療單位特定區(qū)域(如新生兒科、ICU、手術(shù)室等)分離菌株的分子分型研究相對較少。本研究擬收集中國南方某婦女兒童專科醫(yī)院短期內(nèi)分離自新生兒科病房的15株白假絲酵母菌進行體外抗菌藥物敏感試驗和MLST研究，為及時有效控制醫(yī)院內(nèi)感染的流行、指導(dǎo)臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 收集2015年4—5月中國南方某婦女兒童醫(yī)院新生兒科病房分離的白假絲酵母菌。

1.2 菌株鑒定及藥敏試驗 采用酵母菌YST鑒定卡(法國生物梅里埃公司)對菌株進行鑒定，采用珠海迪爾酵母樣真菌藥敏試劑盒(DL-96FUNGUS)對菌株進行藥敏試驗，試驗藥物包括兩性霉素B、氟康唑、伏立康唑、氟胞嘧啶、伊曲康唑。藥敏結(jié)果判斷參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)抗真菌藥物敏感性試驗解釋標準(M27-S4)。體外藥物敏感試驗質(zhì)控菌株為白假絲酵母菌ATCC 90029，為本實驗室保存的標準菌株。

1.3 MLST

1.3.1 白假絲酵母菌總DNA提取 應(yīng)用Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)并嚴格按照操作步驟提取基因組DNA。同時測定DNA濃度(NanoDrop 2000,Thermo Scientific)，并將提取DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 MLST分析 根據(jù)MLST數(shù)據(jù)庫(http://calbicans.mlst.net/)方案設(shè)計白假絲酵母菌7對管家基因(AAT1a,ACC1,ADP1,MPIb,SYA1,VPS13,ZWF1b)的引物序列。具體引物序列見表1。

1.3.3 PCR擴增產(chǎn)物分析 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分別對7對管家基因進行擴增， PCR反應(yīng)體系(50 μL)： DNA模板2 μL，正反向引物各2 μL， PCR Master Mix 25 μL， ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5 min；變性94℃30 s，退火55℃ 60 s，延伸72℃ 1 min，共30個循環(huán)；終末延伸72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物擴增后進行電泳驗證，然后將擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

測序后的序列采用chormas軟件進行分析，首先將測序結(jié)果提交至白假絲酵母菌MLST數(shù)據(jù)庫(http://calbicans.mlst.net/)中進行分析，分別獲得7個管家基因的等位基因數(shù)值，然后將管家基因等位基因數(shù)值與數(shù)據(jù)庫中的等位基因進行比較，獲得白假絲酵母菌臨床分離株的序列分型(sequence type, ST)。

表1白假絲酵母菌MLST分型中7對管家基因引物序列

Table1Primer sequences of 7 pairs of housekeeping genes inC.albicansMLST

管家基因引物序列(5’-3’)擴增產(chǎn)物大小(bp)AAT1aACTCAAGCTAGATTTTTGGC478CAGCAACATGATTAGCCCACC1GCAAGAGAAATTTTAATTCAATG519TTCATCAACATCATCCAAGTGADP1GAGCCAAGTATGAATGATTTG537TTGATCAACAAACCCGATAATMPIbACCAGAAATGGCCATTGC486GCAGCCATGCATTCAATTATSYA1AGAAGAATTGTTGCTGTTACTG543GTTACCTTTACCACCAGCTTTVPS13TCGTTGAGAGATATTCGACTT741ACGGATGGATCTCCAGTCCZWF1bGTTTCATTTGATCCTGAAGC702GCCATTGATAAGTACCTGGAT

2 結(jié)果

2.1 菌株來源 2015年4—5月該院新生兒科病房共分離白假絲酵母菌15株。菌株來源標本分布：患兒血(8株)，患兒外周靜脈導(dǎo)管(4株)，患兒外周血靜脈導(dǎo)管留置針穿刺點(2株)，醫(yī)務(wù)人員手(1株)。新生兒病房臨床分離的15株白假絲酵母菌中10株來自于4例患者，其中6株菌(菌株編號C6、C12、C13;C3、C14、C15)分別來源于2例患者的外周血、留置針穿刺點和外周靜脈導(dǎo)管，4株菌(C5、C10；C4、C11)分別來源于另外2例患者的外周血和外周靜脈導(dǎo)管，1株分離自醫(yī)護人員手(C9)，其余4株(C1、C2、C7、C8)分別來自不同的患者外周血。

2.2 藥敏結(jié)果 新生兒科病房15株菌株經(jīng)過生化鑒定后均確認為白假絲酵母菌。藥敏試驗結(jié)果顯示14株白假絲酵母菌對伊曲康唑表現(xiàn)為中介(I)，僅1株(編號C1)來源于患兒外周血的白假絲酵母菌對伊曲康唑表現(xiàn)為敏感(S)；15株白假絲酵母菌對兩性霉素B、氟康唑、伏立康唑和氟胞嘧啶均表現(xiàn)為敏感(S)。

2.3 MLST結(jié)果

2.3.1 管家基因擴增結(jié)果 按照MLST官網(wǎng)(http://calbicans.mlst.net/)提供的引物進行擴增，白假絲酵母菌7對管家基因均能擴增出特異性的PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示7個管家基因?qū)?yīng)不同大小的條帶，且無明顯二聚體。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

2.3.2 ST分型結(jié)果 分離的15株白假絲酵母菌7個管家基因的等位基因數(shù)值提交至MLST數(shù)據(jù)庫中獲取對應(yīng)ST值。ST結(jié)果顯示，臨床分離的15株白假絲酵母菌可分為3個ST型別，其中ST 1997為主要流行菌株，具體結(jié)果見表2。

1-7：ACC1；ADP1；MPIb；ZWF1b；VPS13；AAT1a；SYA1；M：DNA Marker-D2000

圖1白假絲酵母菌MLST 7對管家基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

Figure1Electrophoresis results of PCR amplification product of 7 pairs of housekeeping genes inC.albicansMLST

2.3.3 MLST同源性分析結(jié)果 應(yīng)用eBURST程序?qū)Ψ蛛x菌株進行同源性分析，結(jié)果顯示，ST 1997屬于Group 13克隆組；ST 1933屬于Group 20；ST 1359屬于Group 1；3個ST型別均位于不同的克隆組。

3 討論

目前，臨床上由于廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物的廣泛使用，侵入性診療操作的不斷增多，多重耐藥菌、真菌等引起的醫(yī)院感染暴發(fā)流行也隨之增加，已經(jīng)引起了臨床醫(yī)務(wù)工作者的重視[13-14]。白假絲酵母菌為條件致病菌，也是引起真菌血癥的重要病原菌，新生兒科患者由于具備出現(xiàn)醫(yī)院感染的多種危險因素，已經(jīng)成為醫(yī)院感染的高發(fā)人群和重點監(jiān)控對象。采用抗菌藥物敏感性表型分型方法初步判斷醫(yī)院感染暴發(fā)的操作相對簡單，比較適合基層醫(yī)院。但是，細菌在不同抗菌藥物壓力條件下，可形成不同的抗菌藥物藥敏譜型，因此，結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性較差，在對醫(yī)院感染暴發(fā)的調(diào)查中結(jié)果并不準確。本研究除C1(ST 1997)對伊曲康唑表現(xiàn)為敏感外，其余14株(包括ST 1997、ST 1359、ST 1933)對伊曲康唑均表現(xiàn)為中介，所有菌株對兩性霉素B、氟康唑、伏立康唑和氟胞嘧啶均表現(xiàn)為敏感，顯示大部分白假絲酵母菌具有一致的抗菌藥物藥敏譜，但是，ST分型有一定差異。有些病原菌的耐藥譜多變，具有一定的指紋圖譜功能，可簡單作為同源性判斷的依據(jù)；而有些病原菌耐藥譜穩(wěn)定，不同來源的菌株耐藥譜差異很小，則不適宜用于同源性分析。

表2 15株白假絲酵母菌MLST的7對管家基因等位基因數(shù)值及ST型

注：PB為外周血；PVC為外周靜脈導(dǎo)管；H為手；D為留置針穿刺點

臨床上目前常用基因分型方法來鑒定醫(yī)院感染散發(fā)和暴發(fā)菌株、追蹤感染源、了解傳播途徑。細菌基因組受環(huán)境選擇壓力和隨機突變的綜合作用呈多樣性，MLST采用多個管家基因進行分析，通過序列的變化反映菌株之間的進化關(guān)系，具有較高的分辨率，而且，可以通過公共數(shù)據(jù)庫進行共享及比較，已廣泛用于細菌基因分型研究[15]。本研究對新生兒科病房分離的15株白假絲酵母菌進行MLST，分別檢測出3種不同的ST。MLST結(jié)果經(jīng)eBURST進化分析可分為Group 13(13株)；Group 20(1株)和Group 1(1株)，結(jié)果表明該醫(yī)院新生兒科病房白假絲酵母菌血流感染的主要流行菌株屬于Group 13。本研究中，來自同一患兒外周血、外周靜脈導(dǎo)管及靜脈穿刺點的3株菌(C6、C12和C13)以及來自其他3例患兒外周血及外周靜脈導(dǎo)管的6株菌(C3和C15；C4和C11；C5和C10))，藥敏試驗和MLST均證實為同一克隆株，可診斷為導(dǎo)管相關(guān)白假絲酵母菌血流感染。

醫(yī)院感染暴發(fā)是指在醫(yī)療機構(gòu)或其他科室的患者中，短時間內(nèi)發(fā)生3例以上同種同源感染病例的現(xiàn)象[16]。本研究結(jié)果顯示新生兒科病房白假絲酵母菌血流感染為同一克隆株，且具備在時間上和空間上分布集中的特點，因此，初步判定為醫(yī)院感染暴發(fā)。

目前，國內(nèi)關(guān)于醫(yī)院特定區(qū)域的白假絲酵母菌感染的流行病學報道相對較少，肖玉玲等[11]運用MLST方法對來自ICU的15例血流感染患者分離的17株白假絲酵母菌進行分型，共分為15個ST型別，其中3株菌為同一ST型，另外14株菌則分別為14個不同ST型；血流感染的主要流行菌株屬于Group 46和Group 47克隆組。本研究中的ST型別與該研究報道的不同，且分屬不同克隆組，這充分顯示白假絲酵母菌有明顯的地域差異。白假絲酵母菌既能以有性生殖方式進行繁殖，還能以無性生殖方式繁殖后代，因此具有較高的突變頻率。目前，MLST數(shù)據(jù)庫已收集全球范圍內(nèi)經(jīng)過研究證實的3 320個ST型白假絲酵母菌；可以通過不同的聚類分析方法將菌株進行種群結(jié)構(gòu)分類。本研究所分離的3個ST型均屬于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實的ST型。

總之，白假絲酵母菌是引起侵襲性真菌感染常見的病原菌，在引起醫(yī)院血源性感染的微生物中位于第四位[17]。醫(yī)院特定區(qū)域(新生兒科、ICU等)患者多為發(fā)生醫(yī)院感染的高危人群，是醫(yī)院感染管理重點監(jiān)控的對象。通過MLST方法進行分析，可以更好的分析菌株的流行病學和進化特征，從而為預(yù)防和控制病原菌的傳播提供實驗室依據(jù)。同時，為了控制和減少醫(yī)院內(nèi)的交叉感染，應(yīng)加強醫(yī)院內(nèi)的細菌監(jiān)測，嚴格醫(yī)務(wù)人員無菌操作，提高手衛(wèi)生依從性，減少侵入性操作，合理使用抗菌藥物，同時落實嚴格的病區(qū)和房間消毒隔離措施。