藥用輔料構櫞酸的細菌內毒素檢查方法探索

劉桂東

【摘要】建立適合本公司注射劑使用的藥用輔料枸櫞酸的細菌內毒素檢查方法。

【關鍵詞】枸櫞酸 細菌內毒素檢查 干擾試驗

方法：依照《中國藥典》2015年版二部附錄細菌內毒素檢查法試驗和結果判斷，采用pH調節法進行試驗。

結果：以湛江安度斯生物有限公司生產的市售稀釋劑Ⅱ對構椽酸原液進行稀釋，對鱟試劑與內毒素反應最大不產生干擾的濃度為0.25mg·ml-1，使用0.O6EU·ml-1或靈敏度更高的賞鱟劑可對其進行細菌內毒素檢查。

結論：本細菌內毒素檢查法多次試驗結果均符合規定，可用于其質量控制。

枸櫞酸又名檸檬酸，是一種重要的藥用輔料，其易溶于水，常溫下為無色晶體。藥典四1143細菌內毒素檢查法供試品溶液的制備中規定，必要時，可調節被測溶液（或其稀釋液）的pH值，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內為宜，可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖液調節pH值。常用細菌內毒素檢查用水稀釋法和堿性試劑中和法，前者稀釋步驟較多，后者每次進行試驗均需要進行pH調節，耗時較長。故而本文采用稀釋劑Ⅱ進行稀釋和調節。

一、實驗材料

枸櫞酸（湖南華日制藥有限公司，批號20180407，20180408，20180409）；細菌內毒素工作標準品（WSE）；鱟試劑（TAL，批號1610311，0.25EU·ml-1，湛江安度斯生物有限公司；批號1801153，0.06EU·ml-1，湛江安度斯生物有限公司；批號1802207，0.O6EU·ml-1，湛江博康海洋生物有限公司）；細菌內毒素檢查用水（BET，湛江安度斯生物有限公司）；稀釋劑Ⅱ（批號1709120，4ml·Amp-1，湛江安度斯生物有限公司）。

二、方法與結果

（1）細菌內毒素限值的確定L=0.5EU·mg-1。

（2）鱟試劑靈敏度復核參照藥典方法，進行鱟試劑的靈敏度復核試驗。三種鱟試劑的靈敏度均在0.5λ～2λ之間，可用于細菌內毒素檢查。

（3）干擾預試驗。考慮到現有鱟試劑分別為0.25，0.125，0.06和0.03EU·ml-1四個靈敏度。依據公式MVC=λ/L，有效稀釋濃度為0.5～0.0625mg·ml-1。選取靈敏度為0.25EU·ml-1的鱟試劑進行干擾預試驗。將20180407批的枸櫞酸以BET水溶解，制成10mg·ml-1的原液。以稀釋劑Ⅱ對其稀釋，使其終濃度分別為1，0.5，0.25，0.125，0.0625mg·ml-1，將濃度為0.5，0.25，0.125，0.0625mg·ml-1系列溶液記為NPC；同時在濃度為1，0.5，0.25，0.125mg·ml-1溶液中添加等體積4λ濃度的內毒素溶液，使每一濃度試驗液中均含有2λ濃度的細菌內毒素，將此系列溶液記為PPC。取靈敏度為0.25EU·ml-1的TAL分別與上述NPC和PPC進行反應，每一濃度重復做2管。結果表明，枸櫞酸的最高不干擾濃度為0.25mg·ml-1。

（4）正式干擾試驗依據上述預實驗結果，選擇0.125mg·ml-1為樣品的不干擾濃度，選擇0.06EU·ml-1的TAL進行正式干擾試驗。以稀釋劑Ⅱ將枸櫞酸原液分別稀釋至終濃度為0.25mg·ml-1和0.125mg·ml-1，以0.125mg·ml-1溶液作為供試品對照液，試驗重復2管。用0.25mg·ml-1的枸櫞酸溶液將WSE配成濃度為2λ，λ，0.5λ和0.25λ四個系列濃度，試驗重復4管。用BET水將WSE配成2λ，λ，0.5λ和0.25λ四個系列濃度，試驗重復2管。同時以BET水為陰性對照，試驗重復2管。用靈敏度為0.O6EU·ml-1的TAL進行干擾試驗。當供試品對照液和陰性對照均為陰性時，結果按公式Es=1g-1（∑Xs/4）和Et=1g-1（∑Xt/4）計算，其中Xs和Xt分別為BET系列和枸櫞酸系列各反應終點細菌內毒素濃度的對數值。干擾試驗結果見表1和2。

結果表明，陰性對照為陰性且Es在0.5λ～2λ之間，試驗有效。Et在0.5λ～2λ之間，符合規定。

參考文獻：

[1]肖佳音，李慶忠，陳志勇.注射用藥用輔料枸櫞酸細菌內毒素檢查法的可行性研究J].中國藥品標準，2013.

[2]陳莉英，付經國，婁維娜等.枸櫞酸原料質量標準“細菌內毒素檢查法”方法學研究[J].藥學分析雜志，2003.