育麟方改善老齡小鼠卵巢儲(chǔ)備功能的實(shí)驗(yàn)研究*

繆晨韻 章 勤 馬 景# 張 弛

1 浙江省溫州市中醫(yī)院 浙江 溫州 325000

2 浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

3 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

高齡是導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備功能下降（DOR）的主要原因[1]，主要表現(xiàn)為卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量的雙重下降，進(jìn)而導(dǎo)致女性生育能力下降。雖然輔助生育技術(shù)的開(kāi)展為廣大不孕不育家庭帶來(lái)福音，但高齡DOR患者在控制性超排卵過(guò)程中往往表現(xiàn)為卵巢低反應(yīng)[2]。育麟方是浙江何氏婦科的代表方之一，治療腎虛型不孕癥，臨床效果顯著[3]。本實(shí)驗(yàn)主要研究自然衰老致DOR的卵巢組織學(xué)特點(diǎn)及內(nèi)分泌變化規(guī)律，并觀察育麟方對(duì)高齡導(dǎo)致DOR小鼠卵巢儲(chǔ)備功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～8周齡SPF級(jí)健康性成熟雌性C57BL/6小鼠［SCXK(滬)2012-0002］7只，質(zhì)量17.7±1.0g。7～8月齡雌性C57BL/6小鼠［SCXK(京)2012-0001］50只，質(zhì)量28.9±1.7g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)15d，采用分籠架式喂養(yǎng)，予實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)飼料及凈化水喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：DHEA（脫氫表雄酮）：美國(guó)GNC公司，25mg/粒，90粒/瓶；育麟方組成：菟絲子30g，蛇床子6g，枸杞子12g，當(dāng)歸、川芎、熟地、巴戟天、肉蓯蓉各10g，覆盆子、仙靈脾、黨參各15g，炙甘草3g。均購(gòu)自浙江省杭州市中醫(yī)院，經(jīng)該院中藥房鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)。上藥水煎并濃縮為相當(dāng)于生藥1.85g/ml，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｐ∈罂姑缋展芗に?AMH)-ELISA檢測(cè)試劑盒（上海淇岸生物科技有限公司，批號(hào)1612041）；組織學(xué)檢測(cè)試劑：HE染料、4%多聚甲醛、95%乙醇、石蠟等。

1.3 動(dòng)物模型制備：選取7～8月齡C57BL/6老齡鼠50只，連續(xù)觀察陰道脫落細(xì)胞涂片15d，觀察動(dòng)物小鼠動(dòng)情周期變化，如出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂或動(dòng)情間期延長(zhǎng)，則為DOR造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。其中50只小鼠造模成功，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.4 分組及給藥：將造模成功后DOR小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為育麟方低劑量組、育麟方中劑量組、育麟方高劑量組、DHEA組、模型組，每組10只。青年對(duì)照組（7只）與模型組，給予蒸餾水灌胃。DHEA組根據(jù)人體DHEA 1.25mg/kg·d劑量換算并溶解于蒸餾水后，給予0.40ml/d灌胃，每日1次，連續(xù)40d。育麟方低、中、高劑量組分別給予生藥6g/kg、12g/kg、25g/kg灌胃，每日1次，連續(xù)40d。

1.5 觀察指標(biāo)：從灌胃的第1d開(kāi)始，每日08：30對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，連續(xù)40d，同時(shí)記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)。給藥結(jié)束后1～5d內(nèi)將處于動(dòng)情前期或第5d尚未出現(xiàn)明顯動(dòng)情周期的小鼠采用摘眼球取血，離心后分離血清，采用酶聯(lián)免疫測(cè)定血清中AMH水平。取右側(cè)卵巢，剔除周圍結(jié)締組織，置于中性福爾馬林液中固定。常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，制成病理組織切片。分別在光鏡下用4×l 0、10×10、20×10倍數(shù)觀察小鼠卵巢組織學(xué)變化，觀察卵巢最大切面各級(jí)卵泡數(shù)目及黃體數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)描述以表示，所有資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠動(dòng)情周期變化：見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠動(dòng)情周期情況比較（）

表1 各組小鼠動(dòng)情周期情況比較（）

注：與青年對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

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2.2 各組小鼠抗苗勒管激素（AMH）水平變化：見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清抗苗勒管激素水平（）

表2 各組小鼠血清抗苗勒管激素水平（）

注：與青年對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01；與育麟方高劑量組比較，★P＜0.01。

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2.3 各組動(dòng)物卵巢組織學(xué)情況：①青年對(duì)照組：卵巢結(jié)構(gòu)和形態(tài)清晰，各級(jí)卵泡可見(jiàn)，各級(jí)卵泡形態(tài)及數(shù)量正常。初級(jí)卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞完整，透明帶明顯，周圍顆粒細(xì)胞豐富，排列整齊，層數(shù)多。②模型組：卵巢萎縮，髓質(zhì)組織多，卵泡數(shù)目少，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，排列稀疏。閉鎖卵泡較多。③育麟方低劑量組：卵巢偏小，卵巢皮質(zhì)髓質(zhì)結(jié)構(gòu)不清晰，各級(jí)卵泡數(shù)量減少，周圍顆粒細(xì)胞層數(shù)少，次級(jí)卵泡卵泡腔不清晰，內(nèi)見(jiàn)散在顆粒細(xì)胞，黃體數(shù)量少。④育麟方中劑量組：卵巢髓質(zhì)皮質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，各級(jí)卵泡可見(jiàn)，數(shù)量減少，顆粒細(xì)胞排列欠整齊，層數(shù)減少。⑤育麟方高劑量組：卵巢髓質(zhì)皮質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，初級(jí)卵泡卵母細(xì)胞完整，呈橢圓形，周圍可見(jiàn)透明帶，顆粒細(xì)胞層數(shù)為6～8層，次級(jí)卵泡的卵泡腔偏小，可見(jiàn)卵丘。⑥D(zhuǎn)HEA組：各級(jí)卵泡均可見(jiàn)，數(shù)量及形態(tài)接近正常，偶見(jiàn)閉鎖卵泡。初級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞排列整齊緊密，層數(shù)較多。黃體較多，體積大小正常。與模型組比較，育麟方中、高劑量組、DHEA組的初級(jí)卵泡及卵泡總數(shù)增多。

3 討論

根據(jù)DOR的臨床表現(xiàn)，可將其歸于中醫(yī)學(xué)“月經(jīng)過(guò)少”“月經(jīng)先后不定期”“經(jīng)斷前后諸證”等范疇。腎藏精，主生殖，系胞絡(luò)，為沖任之根。如若腎精不足，則沖任失養(yǎng)，血海無(wú)以充盈，胞宮失氣血之溫濡；腎氣虧損，腎陽(yáng)虛衰，則溫化無(wú)力，無(wú)以行血通脈，氣血凝滯。因而腎虛可致氣血、沖任、胞宮失煦，致卵巢儲(chǔ)備功能下降。故補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)血是卵巢儲(chǔ)備功能下降的主要治法。育麟方由浙江何氏婦科歷代門(mén)人根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)所得，是治療女性腎虛型不孕癥的有效方劑。前期研究發(fā)現(xiàn)，育麟方對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能下降患者的中醫(yī)證候均有較好的改善作用，并能改善卵巢內(nèi)分泌功能，提高臨床妊娠率，從而達(dá)到改善卵巢儲(chǔ)備功能的目的[4]。

雌性小鼠性成熟后，卵巢可發(fā)生周期性的排卵與其分泌的相應(yīng)雌性激素水平的周期性變化，同時(shí)伴隨有陰道細(xì)胞學(xué)的周期性變化，故會(huì)出現(xiàn)動(dòng)情周期。因此，動(dòng)情周期的紊亂是反應(yīng)卵巢功能失調(diào)的敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型小鼠的動(dòng)情周期較青年對(duì)照組延長(zhǎng)，動(dòng)情頻率減少，育麟方高劑量組的動(dòng)情周期較模型組縮短，動(dòng)情頻率增加，故育麟方能有效地改善自然衰老造成的動(dòng)情周期紊亂狀況，恢復(fù)正常的動(dòng)情周期。

AMH是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β家族的成員之一，主要來(lái)自于卵巢的竇前卵泡和竇卵泡的顆粒細(xì)胞。AMH參與了卵泡生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)以及FSH敏感性的閾值，可以反映始基卵泡儲(chǔ)備量的大小。AMH與年齡緊密相關(guān)，在整個(gè)生命周期中AMH是在持續(xù)動(dòng)態(tài)變化的，其在20～30歲的時(shí)候達(dá)到頂峰，然后持續(xù)下降直到絕經(jīng)期。在卵巢反應(yīng)性的預(yù)測(cè)評(píng)估上，因其不隨月經(jīng)周期變化和敏感性，AMH被認(rèn)為是各項(xiàng)卵巢功能評(píng)估指標(biāo)中最準(zhǔn)確的。本課題通過(guò)對(duì)老齡小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)育麟方各劑量及DHEA均可提高小鼠血清AMH的水平，其中高劑量組效果最為顯著。并結(jié)合卵巢組織學(xué)及卵泡數(shù)目結(jié)果來(lái)看，育麟方能在一定程度上促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，改善卵巢功能。

本實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，育麟方各劑量組及DHEA組的AMH值均低于青年對(duì)照組（P＜0.01），表明育麟方和DHEA藥物干預(yù)雖可改善卵巢功能，但無(wú)法完全逆轉(zhuǎn)。造成此結(jié)果的原因可能是在自然衰老過(guò)程中，卵巢的氧化性損傷不是完全可逆的，其損傷影響最大的是始基卵泡數(shù)量減少[5]。但通過(guò)藥物干預(yù)提高始基卵泡的發(fā)育率、提高卵泡的質(zhì)量并非是不可能的。綜上，發(fā)揮中醫(yī)中藥的特色優(yōu)勢(shì)改善卵巢功能，對(duì)于幫助女性延緩生殖衰老，提高高齡女性妊娠成功率及活產(chǎn)率有著十分重要的意義。