川楝素提高宮頸癌細胞對順鉑誘導的凋亡信號敏感性作用機制研究

宋晶晶 王 海

浙江省立同德醫院 浙江 杭州 310012

宮頸癌在女性群體中是發病率很高的婦科腫瘤，手術和化療目前仍是治療宮頸癌的主要手段[1-2]。本研究主要探討天然藥物川楝素是否對順鉑誘導的凋亡有協同作用并研究其機制。

1 材料與方法

1.1 材料：順鉑、噻唑藍（MTT）、二甲亞砜（DMSO）和Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(貨號：APOAF)購于德國Sigma-Al dr ich公司。川楝素購于南京春秋生物工程有限公司。DMEM培養基購于美國Gibco公司。細胞蛋白提取液、JC-1線粒體膜電位染料和線粒體分離試劑盒(批號：C3601)購于江蘇碧云天。c-Jun、Bcl-xl、caspase-9、caspase-3和β-act in抗體購于美國Cel l Signal ing公司。增強型化學發光底物（ECL）試劑盒(貨號：32106)購于美國Pier ce公司。

1.2 細胞培養：人宮頸癌細胞系Hel a購于美國ATCC（Amer ican Type Cul tur e Col l ect ion），Hel a細胞系培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃恒溫培養箱中培養，通入5%CO2。

1.3 c-Jun表達質粒構建和轉染：人c-Jun基因的開放閱讀框架全長序列經PCR擴增后以分子克隆的方法與pc DNA3.1連接后構建成c-Jun重組過表達質粒。c-Jun過表達質粒用脂質體2000按試劑操作說明書步驟進行轉染：將2g/ml質粒用脂質體2000進行包裹后將其加入到無血清培養基進行混合。將貼壁的Hel a細胞置于該無血清培養基孵育6小時后棄去無血清培養基并加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養基培養24小時。

1.4 細胞活力檢測：將Hel a細胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組，川楝素組，順鉑組，順鉑+川楝素組及順鉑+川楝素+c-Jun質粒組（簡稱綜合組）。對照組為空質粒轉染的Hel a細胞不加藥物培養48小時，順鉑組為在空質粒轉染的Hel a細胞中加入2mol/L的順鉑培養48小時，川楝素組為在空質粒轉染的Hel a細胞中加入10mol/L的川楝素培養48小時，順鉑+川楝素組為在空質粒轉染的Hel a細胞中加入2mol/L的順鉑和10mol/L的川楝素培養48小時，綜合組為在c-Jun質粒轉染的Hel a細胞中加入2mol/L的順鉑和10mol/L的川楝素培養48小時。藥物處理完畢后在各培養孔中加入20μl 5mg/ml MTT再培養4小時，小心吸去上清液，往孔中加入150μl DMSO，充分震蕩后在570nm波長下用酶標儀檢測OD值，Hel a細胞活力抑制率計算：抑制率=（OD對照組-OD藥物處理組）/OD對照組×100%。

1.5 細胞凋亡實驗：將Hel a細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進行分組處理。處理完畢后按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書用Annexin-V對細胞進行染色孵育20分鐘。之后采用流式細胞術檢測Hel a細胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細胞數占總細胞數的百分比表示。

1.6 線粒體膜電位測定：將Hel a細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進行分組處理。藥物處理完畢后按試劑操作說明書步驟將細胞用JC-1染料進行孵育，孵育完畢后用流式細胞儀檢測JC-1發出的紅色熒光，紅色熒光強度越強，線粒體膜電位越高。

1.7 West er n bl ot實驗：將Hel a細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進行分組處理。藥物處理完畢后將細胞用蛋白提取液提取總蛋白質。之后將提取的總蛋白質用12.5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到醋酸纖維素膜上，用c-Jun、Bcl-xl、caspase-9、caspase-3和βact in抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2小時，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。

1.8 統計學方法：所有實驗重復3次，實驗數據用-x±s表示，并用SPSS 15.0統計分析軟件進行處理，組間均數的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05認為有顯著性差異。

2 結果

2.1 川楝素和順鉑處理下的Hel a細胞的細胞活力抑制率和凋亡率：見表1。

2.2 川楝素通過c-Jun/Bcl-xl途徑提高Hel a細胞對順鉑誘導的凋亡信號的敏感性：West ern bl ot實驗結果顯示順鉑單獨處理會增加Hel a細胞中Bcl-xl的表達水平，而川楝素聯合處理能明顯抑制Hel a細胞中Bclxl的異常表達。然而轉染c-Jun表達質粒后，川楝素對Bcl-xl的抑制作用明顯減弱（圖1），表明川楝素通過c-Jun途徑發揮Bcl-xl表達的抑制作用。流式細胞實驗結果顯示川楝素聯合順鉑能顯著誘導Hel a細胞線粒體膜電位的下降，然而轉染c-Jun質粒后，線粒體膜電位的降低受到抑制（圖2）。同時，川楝素能明顯促進順鉑誘導的凋亡執行分子caspase-9和caspase-3的活化（圖3）。這些結果表明川楝素通過c-Jun/Bcl-xl途徑提高Hel a細胞對順鉑誘導的凋亡信號的敏感性。

表1 川楝素和順鉑處理下的Hel a細胞的細胞活力抑制率和凋亡率（，%）

表1 川楝素和順鉑處理下的Hel a細胞的細胞活力抑制率和凋亡率（，%）

注：與順鉑組比較，*P＜0.05；與川楝素組比較，#P＜0.05；與順鉑+川楝素組比較，&P＜0.05。

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圖1 川楝素和順鉑對Hel a細胞Bcl-xl表達水平的影響

圖2 順鉑和川楝素對Hel a細胞線粒體膜電位的影響

圖3 順鉑和川楝素對Hel a細胞caspase-9及caspase-3活化的影響

3 討論

川楝素是中藥川楝子中的主要活性成分，具有很強的藥理學活性。近年來的研究發現川楝素還具有一定的抗腫瘤作用，對多種惡性腫瘤均有良好的輔助治療作用[3]，具有高效低毒的特點。然而，川楝素是否對宮頸癌的順鉑化療有輔助治療作用，至今還未充分報道。在本研究中，筆者發現川楝素聯合處理能顯著提高宮頸癌細胞在順鉑治療下的細胞活力抑制率和凋亡率，表明川楝素是一種良好的化療輔助治療藥物，能顯著提高宮頸癌細胞對順鉑誘導的凋亡作用的敏感性。

c-Jun是一種轉錄因子蛋白，屬于核轉錄激活蛋白1家族成員。研究表明當腫瘤細胞的DNA受順鉑等化療藥物損傷時，c-Jun蛋白會發生活化，活化的c-Jun能促進腫瘤細胞的增殖和轉移，并抑制腫瘤細胞發生凋亡[4]。更為重要的，文獻報道c-Jun的過度活化是導致腫瘤細胞發生化療抵抗的重要機制[5]。在本研究中，實驗結果發現當宮頸癌細胞用順鉑進行治療時，宮頸癌細胞中的c-Jun蛋白會發生過表達以對抗順鉑對宮頸癌細胞的殺傷。然而當用川楝素進行聯合治療時，宮頸癌細胞中的c-Jun蛋白表達水平受到明顯抑制，并由此抑制了順鉑引起的c-Jun蛋白的過表達，這可能是川楝素增強順鉑抗宮頸癌活性的機制。當在宮頸癌細胞中轉染c-Jun重組表達質粒使c-Jun在宮頸癌細胞中強制表達后，川楝素對順鉑的協同抗宮頸癌活性受到了明顯的抑制，證明了c-Jun的下調是川楝素發揮協同作用的重要機制。

作為c-Jun信號通路的下游蛋白，實驗結果發現宮頸癌細胞中的Bcl-xl抗凋亡蛋白在順鉑治療下會發生過表達以對抗順鉑誘導的凋亡，然而川楝素聯合處理能通過下調c-Jun蛋白的表達抑制宮頸癌細胞中Bcl-xl的表達水平。因此，實驗結果發現川楝素能明顯促進順鉑對宮頸癌細胞線粒體途徑凋亡的誘導，活化細胞中的caspase-9和caspase-3，最終導致凋亡的發生。