益腎安宮方對(duì)復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者外周血Th17/Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響*

張 偉 王晨曄 丁彩飛 孫 忻

浙江省杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院 浙江 杭州 310003

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)病因復(fù)雜，近年來(lái)的研究表明，免疫因素，特別是與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子以及調(diào)節(jié)細(xì)胞在RSA的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用[1-2]。本科以益腎安宮方治療RSA患者，取效滿(mǎn)意，觀察其對(duì)RSA患者外周血Th17/Tr eg細(xì)胞、白介素-6（IL-6）、白介素-17（IL-17）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）表達(dá)水平的影響，從細(xì)胞及分子水平初步闡明作用機(jī)制。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇：分述如下。

1.1.1 RSA病例組：選擇2016年7月至2017年12月于杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科就診的RSA患者60例（妊娠12周內(nèi)，有RSA病史），簽署知情同意書(shū)后，隨機(jī)將其分為治療組與對(duì)照組，每組30例。治療組平均年齡31.60±5.06歲，平均自然流產(chǎn)次數(shù)2.40±0.67次；對(duì)照組平均年齡31.83±5.56歲，平均自然流產(chǎn)次數(shù)2.47±0.68次。

1.1.2 正常組：選擇同期于本院就診的正常早孕期女性30例（妊娠12周內(nèi)，無(wú)自然流產(chǎn)病史）。平均年齡29.87±3.93歲。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)：西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》（全國(guó)高等醫(yī)藥院校教材第7版）的相關(guān)內(nèi)容制定。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)證候部分》《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002年版)及《中醫(yī)婦科學(xué)》（新世紀(jì)全國(guó)高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材第2版）的相關(guān)內(nèi)容制訂。

1.3 治療方案：對(duì)照組結(jié)合患者血孕酮水平給予黃體酮針20～40mg，1日1次，肌肉注射保胎治療。治療組在此基礎(chǔ)上配合中醫(yī)辨證施治，分為腎虛血熱型和脾腎兩虛型，前者給予益腎安宮Ⅰ號(hào)方（保陰煎加減：生地、熟地、炒白芍、山藥、炒川斷、黃芩、桑寄生各15g，阿膠珠、旱蓮草各12g，甘草5g）；后者給予益腎安宮Ⅱ號(hào)方［壽胎丸合四君子湯加減：炒黨參、炒川斷、桑寄生、杜仲、炒白芍、熟地各15g，菟絲子30g，炒白術(shù)、茯苓、阿膠珠（烊兌）各12g，甘草5g］。每日1劑。水煎服，早晚分服。7天為1個(gè)療程。連續(xù)服用至孕12周。

1.4 標(biāo)本采集：RSA治療組及對(duì)照組分別于治療前、治療后（孕12周時(shí)）抽取靜脈血，正常組于首次就診時(shí)抽取。所有研究對(duì)象均于清晨采集空腹靜脈血5ml，其中3ml全血加入肝素鈉抗凝管，應(yīng)用Ficol l淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(PBMC)；另2ml全血不抗凝，在小試管中自然凝血后收集血清，-70℃保存待用。

1.5 檢測(cè)方法：采用流式細(xì)胞儀測(cè)定各樣本中Th17和Tr eg細(xì)胞比例，具體操作方法按照試劑盒說(shuō)明規(guī)范進(jìn)行；并嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行規(guī)范操作，測(cè)定IL-6、IL-17、TGF-β1血清樣本的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其濃度值。

1.6 臨床療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：參照第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002年版)的相關(guān)內(nèi)容修改制定：①治愈：妊娠超過(guò)2O周，孕20周時(shí)B超檢查示胎兒發(fā)育正常，與孕周相符，伴隨的臨床癥狀和體征消失或明顯改善；②好轉(zhuǎn)：妊娠超過(guò)以往流產(chǎn)最長(zhǎng)孕周，但未超過(guò)20周，于以往流產(chǎn)孕周進(jìn)行B超檢查示胚胎(胎兒)發(fā)育正常，與孕周相符，伴隨的臨床癥狀和體征有所改善；③未愈：妊娠未超過(guò)以往流產(chǎn)最長(zhǎng)孕周即發(fā)生流產(chǎn)，伴隨的臨床癥狀和體征無(wú)改善或有加重。B超檢查示子宮大小與孕周基本相符或小于孕周，胚胎發(fā)育不良或停止發(fā)育。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床療效比較：見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床療效比較

2.2 各組外周血Th17細(xì)胞與Tr eg細(xì)胞百分率、Th17/Tr eg比值比較：見(jiàn)表2。

表2 各組外周血Th17細(xì)胞與Tr eg細(xì)胞百分率、Th17/Tr eg比值比較（）

表2 各組外周血Th17細(xì)胞與Tr eg細(xì)胞百分率、Th17/Tr eg比值比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組治療后比較，#P＜0.05；與本組治療前比較，△P＜0.05。

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2.3 各組外周血細(xì)胞因子水平比較：見(jiàn)表3。

表3 各組外周血IL-6、IL-17及TGF-β1水平比較（）

表3 各組外周血IL-6、IL-17及TGF-β1水平比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組治療后比較，#P＜0.05；與本組治療前比較，△P＜0.05。

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3 討論

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)屬中醫(yī)學(xué)“滑胎”范疇，亦稱(chēng)“數(shù)墮胎”“屢孕屢墮”等。滑胎病機(jī)主要為母體沖任損傷，胎元不健。胎兒居于母體，全賴(lài)母體腎以系之，氣以載之，血以養(yǎng)之，沖任以固之。若母體腎氣健壯，氣血充實(shí)，沖任通盛，則胎固母安；反之則滑胎。胎元不健，多由父母先天之精氣虧虛，兩精雖能結(jié)合，然先天稟賦不足，致使胚胎損傷或不能成形，或成形易損，故而屢孕屢墮。病性以虛為主，或?yàn)樘搶?shí)夾雜之證。對(duì)滑胎者，治療當(dāng)“預(yù)培其損”，孕前宜以補(bǔ)腎健脾，益氣養(yǎng)血，調(diào)理沖任為主；孕后即應(yīng)積極進(jìn)行保胎治療。益腎安宮Ⅰ號(hào)方及益腎安宮Ⅱ號(hào)方分別化裁自中醫(yī)經(jīng)典名方保陰煎、壽胎丸合四君子湯。前者方中炒川斷、寄生補(bǔ)腎固沖，熟地黃、阿膠珠補(bǔ)血養(yǎng)陰，黃芩清熱安胎，生地清熱涼血，旱蓮草滋補(bǔ)肝腎，山藥健脾養(yǎng)胃，白芍養(yǎng)血斂陰，甘草調(diào)和諸藥，全方共奏益腎養(yǎng)陰、清熱涼血、固沖安胎之功。后者方中杜仲、炒川斷、寄生、菟絲子補(bǔ)腎益精，炒黨參、炒白術(shù)、茯苓健脾益氣，熟地、阿膠珠補(bǔ)血養(yǎng)陰，炒白芍養(yǎng)血斂陰，甘草調(diào)和諸藥，全方共奏補(bǔ)腎健脾、益氣養(yǎng)血、固沖安胎之效。

近年來(lái)隨著免疫學(xué)領(lǐng)域的迅速拓展，發(fā)現(xiàn)RSA的發(fā)生與免疫因素密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg細(xì)胞在妊娠過(guò)程中發(fā)揮著不可忽視的作用，并且可以解釋更多關(guān)于妊娠失敗的病理機(jī)制。本研究結(jié)果表明：RSA治療組與RSA對(duì)照組外周血中Th17細(xì)胞比例均高于正常組，而兩組Tr eg細(xì)胞比例均低于正常組，兩組Th17/Tr eg比值均高于正常組，提示RSA患者外周血中Th17細(xì)胞比例高于健康孕婦，Tr eg細(xì)胞比例低于健康孕婦，存在Th17/Tr eg平衡失調(diào)。Th17細(xì)胞產(chǎn)生的最重要的效應(yīng)因子是IL-17，IL-17可與靶細(xì)胞表面IL-17受體（IL-17R）結(jié)合，具有動(dòng)員和富集中性粒細(xì)胞及促炎作用，可有效介導(dǎo)病變組織的炎性反應(yīng)[3]。IL-6和TGF-β1是Th細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與Th17細(xì)胞和Tr eg細(xì)胞的分化密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，RSA治療組與RSA對(duì)照組外周血IL-6、IL-17水平均高于正常組，而TGF-β1水平均低于正常組，提示RSA患者外周血IL-6、IL-17水平高于健康孕婦，而TGF-β1水平卻低于健康孕婦。聯(lián)合使用益腎安宮方治療后，RSA患者外周血中Th17細(xì)胞比例下降至接近健康孕婦水平，Tr eg細(xì)胞比例上升至接近健康孕婦水平，RSA患者外周血Th17/Treg比值下降，Th17/Tr eg失衡現(xiàn)象得以改善，Th17/Tr eg平衡向Treg方向偏倚，有利于妊娠的維持。RSA患者外周血IL-6、IL-17水平下降至接近健康孕婦水平，TGF-β1水平上升至接近健康孕婦水平，推測(cè)益腎安宮方通過(guò)降低RSA患者外周血IL-6、IL-17水平，升高其TGF-β1水平，促使部分初始CD4+T細(xì)胞不斷分化成Tr eg細(xì)胞，抑制Th17細(xì)胞的產(chǎn)生，使Th17/Tr eg比值維持在正常妊娠狀態(tài)，最終有利于妊娠的結(jié)局。