高效液相色譜法測(cè)定清熱解毒分散片中綠原酸含量

吳建明，丁京偉，趙 準(zhǔn)，朱 婷，葉志學(xué)，沈漢福，沈彩虹

（浙江維康藥業(yè)股份有限公司，浙江 麗水 323000）

清熱解毒分散片為復(fù)方中成藥，其配方起源于清熱解毒片，由生石膏、金銀花、玄參、地黃、連翹、梔子、甜地丁、黃芩、龍膽、板藍(lán)根、知母、麥冬12味中藥組方，功能主治為清熱解毒，用于治療流感、上呼吸道感染及各種發(fā)熱性疾病[1]。分散片是指在水中能迅速崩解并均勻分散的片劑[2]，中藥分散片同時(shí)具備液體制劑和固體制劑的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，分散度大，溶出迅速，生物利用度高，服用方式多樣化，制備方法簡(jiǎn)單易行，是一種應(yīng)用前景廣闊的中藥口服新劑型[3]。金銀花為方中君藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效。綠原酸類(lèi)化合物如綠原酸和異綠原酸是金銀花的主要有效成分，綠原酸為其主要活性成分之一[4]。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定金銀花中綠原酸含量，進(jìn)一步對(duì)清熱解毒分散片進(jìn)行質(zhì)量控制[5]221。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括G1311A泵、G1329A進(jìn)樣器、G1314B檢測(cè)器、G1316A柱溫箱（美國(guó)安捷倫公司）；BS124S型電子分析天平（檢測(cè)精度為0．1‰，德國(guó)賽多利斯股份有限公司）；KQ－500DB型超聲波清洗器（功率為500 W，昆山市超聲儀器有限公司）。

1．2 試藥

綠原酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以 99．3%計(jì)，批號(hào)為 110753－201716）；清熱解毒分散片（浙江維康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為B161201，B161202，B161203）；甲醇（色譜純，批號(hào)為164488，純度為 99．9% ），乙腈（色譜純，批號(hào)為1606018，純度為99．9%），均購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；甲醇（分析純，批號(hào)為20151216，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度不低于99．5%）；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent SB －C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 － 0．4% 磷酸（10 ∶90）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；流速：1 mL／min。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取 1．0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，棄初濾液，取續(xù)濾液，再用微孔濾膜（0．45 μm）濾過(guò)，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取按樣品制備工藝制備的缺金銀花陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2．3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取 2．2項(xiàng)下 3種溶液各 10 μL，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液在對(duì)照品溶液及供試品溶液色譜峰相應(yīng)位置無(wú)綠原酸峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明專(zhuān)屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含綠原酸0．07 mg的溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液2，4，6，8，10，14 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝2×106X －10 383，r＝0．999 9（n＝6）。結(jié)果表明，綠原酸進(jìn)樣量在 0．14 ～ 0．98 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果綠原酸面積的 RSD為0．29%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，16 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果綠原酸含量的 RSD為0．28%（n＝5），表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為B161201）樣品5份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果綠原酸平均含量為每片 1．55 mg，RSD 為 1．60%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取6份已知含量的樣品（批號(hào)為 B161201）約 0．5 g，分別加入綠原酸對(duì)照品溶液0．8，1．0，1．2 mL，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 綠原酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2．4 樣品含量測(cè)定

取清熱解毒分散片3批，依法檢測(cè)。結(jié)果批號(hào)分別為B161201，B161202，B161203的3批樣品中綠原酸含量分別為每片 1．55，1．57，1．64 mg。

3 討論

3．1 色譜柱選擇

曾選擇3種不同廠家的色譜柱Agilent SB－C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），YMC －ODS 分析柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），Phenomenex－ C18柱（250 mm × 4．6 mm，5 μm），考察了方法的耐用性，分離度、理論板數(shù)均能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。綜合對(duì)稱因子等各種因素，選擇 Agilent SB － C18柱（250 mm × 4．6 mm，5 μm）為色譜柱。

3．2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

對(duì)綠原酸進(jìn)行紫外掃描（200～600 nm），發(fā)現(xiàn)綠原酸在327 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且吸收強(qiáng)度適宜，其他組分響應(yīng)值相對(duì)較小，結(jié)合文獻(xiàn)[6－7]，選擇327 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3．3 流動(dòng)相選擇

綠原酸為含有羥基和鄰二酚羥基的強(qiáng)極性有機(jī)酸[8]，溶于水后有部分解離，容易發(fā)生主峰拖尾、重復(fù)性差等現(xiàn)象，因此需在流動(dòng)相中加入一定比例的酸，能抑制酸解離，有助于提高主峰與干擾峰的分離度，改善峰形[9－10]。試驗(yàn)選用甲醇 －水 －甲酸（30∶70 ∶0．2）和乙腈 －0．4%磷酸（10∶90）為流動(dòng)相，對(duì)流動(dòng)相不同組分和比例進(jìn)行調(diào)節(jié)，讓其能排除其他成分的干擾，綠原酸保留時(shí)間和峰形都適宜，最后選定流動(dòng)相為乙腈－0．4%磷酸(10∶90)。

3．4 提取溶劑選擇

綠原酸易溶于醇、水，難溶于氯仿、乙醚。試驗(yàn)分別考察乙醇、甲醇、50%甲醇提取溶劑，超聲提取、加熱回流提取方法及20，30，40 min超聲提取時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果30 min后測(cè)定值達(dá)到穩(wěn)定值，超聲提取和回流提取所提取出的綠原酸含量結(jié)果非常接近，但超聲提取比回流提取更簡(jiǎn)便快捷。由于樣品溶液中成分相對(duì)復(fù)雜，用50%甲醇方法提取效果較好，提取比較完全，而且雜質(zhì)峰相對(duì)較少。故基于操作簡(jiǎn)便等各方面考慮，以50%甲醇為提取溶劑，超聲處理30 min即可[11－12]。

3．5 質(zhì)控指標(biāo)選擇

清熱解毒分散片是一種新型現(xiàn)代化中藥劑型，2015年版《中國(guó)藥典（一部）》收載了清熱解毒口服液和清熱解毒片，清熱解毒口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)黃芩苷進(jìn)行了含量測(cè)定[5]1552，清熱解毒片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)黃芩苷和梔子苷2種成分進(jìn)行了含量測(cè)定[5]1553，但未對(duì)組方中的其他組分進(jìn)行含量測(cè)定。考慮到清熱解毒分散片方中金銀花的用量和功效遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于黃芩和梔子，綠原酸為金銀花中的主要活性成分之一，對(duì)綠原酸含量的測(cè)定能直接反映藥品質(zhì)量，確保療效，控制產(chǎn)品質(zhì)量。且不同廠家生產(chǎn)的品種中綠原酸的含量會(huì)存在一定差異，故本試驗(yàn)以綠原酸為質(zhì)控指標(biāo)[13－15]。