不同質量濃度脂多糖對人肺上皮細胞活性的影響*

姜曉芳，陳 霞，楊 艷，馮 靜

（中國人民解放軍第324醫院兒科，重慶 400020）

急性肺損傷（ALI）可以由嚴重感染、創傷等多種因素導致，臨床常見為急性進行性加重的呼吸困難和難以糾正的低氧血癥[1]。雖然國內外學者致力于ALI的防治研究已有多年，但發病率仍居高不下，病死率高達30% ～40%[2]。目前，ALI的細胞模型建立最多見的是采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導[3]，但誘導濃度以及細胞模型建立成功的標準并不統一，使用的LPS誘導濃度相差可達10倍以上，導致研究的標準不易掌握。基于此，本研究中通過采用不同質量濃度LPS誘導肺上皮細胞，觀察細胞活性的變化，為ALI相關細胞實驗提供參考。

1 材料與方法

1．1 試劑、材料與儀器

LPS(Sigma，L2880)；CCK －8 試劑盒（日本同仁）；細胞培養瓶（Corning公司）；特級胎牛血清（GIBCO）；細胞培養板（NEST）；人肺上皮細胞株（A549，南京科佰生物科技有限公司）。ReverTra Ace－a－二步法RT－PCR KIT（日本東洋紡）；超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司）；CO2細胞培養箱（Thermo Scientific）；倒置顯微鏡（Leica公司）。

1．2 方法

用不同質量濃度 LPS（0．050，0．100，0．125，0．250，0．500，1．000，5．000，10．000，50．000，100．000 μg ／mL）刺激人肺上皮細胞建立ALI細胞模型，48 h后應用CCK－8試驗檢測不同質量濃度的LPS對人肺上皮細胞的活性的影響。采用寶生物公司RNAiso Plus提取細胞總 RNA，然后采用寶生物公司 SYBR．Premix Ex TaqTMII進行實時定量PCR反應，引物序列如下。

細胞間黏附分子－1(ICAM－1)F － 5′GCCCGAGCTCAAGTGTCTAA 3′R － 5′GGAGAGCACATTCACGGTCA3′

1．3 統計學處理

繪圖及數據分析使用Excel和SPSS 17．0統計軟件完成。計量資料以s表示，兩組獨立樣本采用 t檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 LPS誘導肺上皮細胞48 h后細胞活性的變化

不同質量濃度LPS刺激人肺上皮細胞48 h，結果見圖1。可見，10 μg／mL LPS即可誘導肺上皮細胞活性明顯下降，與 5 μg／mL LPS比較差異顯著（P ＝0．020 6＜0．05）。當LPS質量濃度為10～50 μg／mL時，細胞活性處于平臺期，差異不顯著，但高于50 μg／mL時肺上皮細胞活性再次出現明顯下降，與100 μg／mL LPS比較有顯著差異（P ＝0．040 8＜0．05）。

圖1 不同質量濃度LPS誘導肺上皮細胞48 h后細胞活性變化

2．2 LPS刺激人肺上皮細胞的細胞形態變化

結果見圖2。當 LPS質量濃度高于50 μg／mL時，肺上皮細胞壞死比較明顯；當LPS質量濃度低于10 μg／mL時，肺上皮細胞形態無明顯變化。

圖2 光鏡下不同質量濃度LPS誘導A549細胞形態(×100)

2．3 LPS誘導肺上皮細胞48hICAM－1mRNA表達量

LPS 質量濃度為 0，5，10，50，100，200 μg／mL 時，誘導肺上皮細胞48 h ICAM－1 mRNA表達量分別為1，(5．5 ± 1．4)，(12．5 ± 7．8)，(23．7 ± 7．5)，(25．8 ± 5．1)，(28．5 ±9．4)μg／mL。其中 10，50 μg／mL 時 A549 細胞ICAM－1 mRNA表達量與 5 μg／mL LPS比較有顯著升高（P ＝ 0．016 9，0．005 ＜ 0．05）。

3 討論

ALI模型是研究ALI／急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)發病機制、有效療法的重要實驗手段[4]，病理特征可表現為肺微血管和肺泡上皮損傷、肺毛細血管通透性增加等。現國內外已成功建立創傷性、放射性、內毒素性多種肺損傷模型，但最經典模型為LPS誘導的ALI細胞或動物模型。LPS是革蘭陰性菌細胞壁中的一種成分，對宿主有害，可引起發熱、白細胞反應、內毒素血癥等。LPS引起的全身敗血癥是ALI／ARDS的常見病因，在許多ALI患者的肺組織中，無論有無細菌感染，都能檢測到革蘭陰性菌內毒素LPS的存在[5－6]。

目前，關于ALI動物模型建立的標準和方法已較成熟，如腹腔注射LPS、氣管滴注LPS及尾靜脈注射LPS是典型的原發性或繼發性ALI模型，也稱為間接或直接ALI模型[7－9]。但尚無 ALI細胞模型建立的標準。發生ALI時，主要病理學特征表現為上皮細胞損傷和中性粒細胞等炎性細胞浸潤和滲透性肺水腫的形成[10]。故國內外現大多采用LPS直接誘導肺上皮細胞，觀察細胞活性及細胞因子水平的變化[11]，特別是肺上皮細胞的凋亡，可誘導大量肺上皮細胞丟失，促發ALI的進展[12]。CCK－8法是檢測細胞增殖／毒性的常見試驗[13－14]。ICAM－1是參與許多炎癥性疾病的重要病理生理基礎，是ALI發生、發展的關鍵分子標志[15－16]。

本研究中發現，應用不同質量濃度LPS刺激人肺上皮細胞48 h后，10 μg／mL LPS即可誘導肺上皮細胞活性明顯下降（P＜0．05），但細胞壞死不明顯。LPS質量濃度高于50 μg／mL時，肺上皮細胞活性持續下降，但細胞壞死比較明顯。建議LPS實驗質量濃度控制在10～50 μg／mL為宜。本研究中對 LPS誘導后的肺上皮細胞代表性炎性因子 ICAM－1 mRNA測定發現，LPS質量濃度為10 μg／mL時，ICAM－1 mRNA表達量與5 μg／mL LPS有顯著差異；但 LPS質量濃度高于50 μg／mL 時，如 100 μg／mL 時 ICAM －1 mRNA 表達量與50 μg／mL比較無顯著差異。進一步提示LPS質量濃度控制在10～50 μg／mL對ALI細胞模型的意義。

本研究中為建立ALI細胞模型的標準提供了較準確的基礎實驗依據，但由于細胞株及LPS來源不同可能會存在一定濃度差異。在下一步研究中，課題組也將繼續尋找能更加準確反映ALI的發生和發展過程的細胞病理學或免疫學變化指標。