白細胞介素-27基因多態性與結核性胸腔積液的相關性分析

黃娜 魏明莉 王貝 李萬成

在臨床上有很多原因都可能引起胸腔積液，而結核性胸腔積液是胸腔積液中最常見的原因之一。白介素-27(interleukin-27, IL-27)屬于IL-12家族中的一員[1]，是免疫介導炎癥性疾病的一個重要的介質。在炎癥反應的初期IL-27是促進T輔助細胞1(helper T cell1, Th1)應答和γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)生成的主要因素，而在炎癥反應的晚期則起著相對次要的免疫調控作用。IL-12是一個異二聚體抗炎癥反應的細胞因子，由IL-12A和IL-12B分別編碼p35和p40的兩個亞單位構成。p40亞單位的表達受活化的巨噬細胞嚴格的調控和制約。研究表明IL-27在炎癥性疾病、抗腫瘤、自身免疫性疾病和寄生蟲感染中起到關鍵作用[2]。目前，有關IL-27基因多態性與結核性胸腔積液的文獻罕有報道。為此，我們采用PCR/RFLP的方法，分析IL-27基因多態性與結核性胸腔積液的相關性，報道如下。

材料與方法

一、研究對象

選取2015年1月至2016年12月在成都醫學院第一附屬醫院呼吸內科就診且經胸腔鏡病理確診的漢族結核性胸腔積液患者160名，男87例，女73例；年齡( 24.2±5.7) 歲。選擇190名健康對照體檢者為對照組，男102例、女88例，年齡( 25.3±6.4) 歲。兩組之間在性別、年齡上差異無統計學意義。

二、研究方法

1. 基因組DNA的提?。?每位受試者簽訂知情同意書后，采集(包括結核性胸腔積液患者和健康對照體檢者)靜脈血約4ml，EDTA-Na抗凝，提取基因組DNA后，-20 ℃保存備用。

2. PCR擴增、PCR-RFLP及測序分析： 查閱相關文獻并根據Genbank dbSNP數據庫中核對序列，選取了IL-27其3個位點，編號分別為： rs181206、rs153109和rs17855750(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。PCR引物的設計參照genebank數據庫提供的全序列，運用引物設計軟件進行設計并合成各位點所需引物及其內切酶[3]。用于擴增IL-27 -964A /G(rs153109)，上游引物序列F:5′-TTGACGTCTCGTGAACTAGCCAG-3′，下游引物序列R:5′-TCTCATGACCACTCGAGCTAG-3′；用于擴增IL-27 4730T / C(rs181206)的上游引物序列F: 5′-GCGATACCGCCTCAGCTCT-3′，下游引物序列R:5′-CCTTCGAAGAGAGGTCCACG-3′；用于擴增IL-27 2905T /G(rs17855750)上游引物序列F: 5′-CAGCAGCTCCAGCTGGCAGC-3′，下游引物序列R:5′-AGCTGTTCGGCGAGACGTATA-3′。PCR反應體系總體積為25 μl，94 ℃預變性5 min, 94 ℃變性30 s, 62 ℃退火40 s, 72 ℃延伸40 s, 共30 個循環, 72 ℃終末延伸5 min RFLP反應體系總體積10 μl，ddH2O 6.6 μl ，PCR產物2 μl，內切酶0.4 μl(IL-27-964A /G、4730T/C和2905T /G均選用的XhoⅠ內切酶)。最后將PCR產物送測序，進一步明確基因型， 3個位點的PCR產物大小分別為119 bp 、132 bp、120 bp。

三、統計學方法

采用SPSS22.0統計學軟件進行統計分析?；蛐秃偷任换蝾l率均應用直接計數法。計數資料采用χ2檢驗進行單因素分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

各基因型和等位基因頻率確認符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律。本組160名結核性胸腔積液患者和190名健康對照者進行基因型和等位基因頻率檢測，在結核胸腔積液組和對照組之間，IL-27-964A/G位點基因型分布頻率有顯著差異(P=0.000), 結核性胸腔積液組AA基因型頻率(48.1%)明顯高于對照組(26.8%), 結核性胸腔積液組-964A等位基因頻率(66.3%)明顯高于對照組(55.8%)(P=0.000)。在結核性胸腔積液組和健康對照組之間，IL-27-964A/G的基因型和等位基因頻率的差異有統計學意義(P均<0.05)。而IL-27 4730T/C和2905T/G基因型和等位基因頻率差異無統計學意義(P均>0.05)，見表1。

表1 結核性胸腔積液組與健康對照組基因型及等位基因頻率[n(%)]

討 論

IL-27主要由抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)產生，具有抗炎癥反應[4]和抗腫瘤免疫等多種生物學功能。IL-12激發許多生物反應：它既可以刺激活化的NK細胞和T細胞增殖，又可以提高NK細胞和T細胞介導的細胞生物活性，從而誘導IFN-γ的生成。研究表明在腫瘤組織和自身免疫性疾病中IL-27表達明顯增高，且其增高的程度與疾病的嚴重程度密切相關[5-7]。在感染炎性反應早期IL-27既可以直接參與Th1細胞分化，又可以刺激T細胞活化增生產生IFN-γ等細胞因子，促進Thl型免疫反應[8]。IL-27信號轉導分子STAT1和STAT3通過Janus激酶(Januskinase, JAK)家族轉導蛋白STAT信號通路的激活而傳遞，發揮主要作用的信號通路是JAK1/STAT1和JAK1/STAT3。IL-27和WSX-1/gp130受體復合物結合后激活JAK1/STAT1、JAK1/STAT3信號轉導通路，從而發揮相應的生物學作用。激活STAT1對Th1細胞的增殖分化具有主要作用，而STAT3具有抑制細胞因子產生的作用，雖然STAT3活化可激活下游IL-6R起到促進炎癥反應作用，但同時可激活IL-10R發揮抑制炎癥反應作用，而且IL-27作用于初始CD4+T細胞，短暫激活STAT1和STAT3，誘導Th1型免疫反應過程，但是，對于活化的CD4+T細胞，經過IL-27作用，STAT3可持續被激活，從而起到免疫抑制的作用；而此時STAT1的作用卻并不明顯。故認為STAT3的短暫激活具有促炎作用，而持續激活具有免疫抑制作用。

羅俊華等[9]研究發現IL-27在結核性胸腔積液的炎性反應中起到重要作用，有可能成為鑒別結核性胸腔積液和惡性胸腔積液一項重要指標，聯合檢測IL-27與INF-γ、ADA能進一步提高結核性胸腔積液診斷效率。戰玉助等[10]研究表明IL-27 -964A/G基因多態性可能與結核病易感性密切相關。這些研究結果與我們的研究結果基本一致。

本文采用了病例對照的方法客觀的評價了IL-27基因對結核性胸腔積液的遺傳易感性的影響，發現IL-27 -964A/G基因型和等位基因頻率在結核性胸腔積液組和對照組之間差異有統計學意義，這表明IL-27-964A/G基因是結核性胸腔積液的遺傳易感基因。而IL-27 2905T/G、4730T/C 兩個位點的基因型和等位基因頻率在結核性胸腔積液組和對照組之間差異無統計學意義，說明這兩個位點的基因多態性與結核性胸腔積液無相關性，因此這兩個位點可能不是結核性胸腔積液易感性的相關位點。本研究發現，IL-27-964A/G基因多態性可能與結核性胸腔積液遺傳易感性有關，這與文獻研究基本一致[9-10]，因此IL-27可能在結核性胸腔積液的發生、發展中起到了一定的作用。當然，本研究樣本量較少，尚需要大樣本的數據進行進一步的統計分析證實IL-27-964A/G基因多態性與結核性胸腔積液的相關性。

綜上所述，IL-27在結核病的發生、發展中起到了重要作用，從遺傳學的角度來講，有利于結核易感人群的篩查。

參 考 文 獻

1 李敬萍, 關鍵, 許西琳, 等. IL-27在結核性胸膜炎胸水中的表達及其意義[J]. 吉林醫學, 2013, 34(19): 3752-3754.

2 Yoshimoto T, Chiba Y, Furusawa J, et al. Potential clinical application of interleukin-27 as an antitumor agent[J]. Cancer Sci, 2015, 106(9): 1103-1110.

3 黃娜, 姜軼, 楊帆, 等. IL-27基因多態性與慢性阻塞性肺疾病相關性的研究[J]. 臨床肺科雜志, 2015, 20(3): 456-458.

4 童欣欣, 呂芳麗. 白細胞介素27在寄生原蟲感染免疫中的作用研究進展[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2014, 32(3): 234-238.

5 班春梅, 李文倩, 李建平, 等. IL-27抗腫瘤作用機制的研究進展[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2016, 32(3): 410-413.

6 Hu T, Zhao H, Wang K, et al. Association of IL-27 polymorphisms and cancer risk in Chinese population[J]. Recept Signal Transduct Res, 2014, 22(7): 1-4.

7 Di Carlo E, Sorrentino C, Zorzoli A, et al. The antitumor potential of interleukin-27 in prostate cancer[J]. Oncotarget, 2014, 5(21): 10332-10341.

8 Wojno ED, Hosken N, Stumhofer JS, et al. A role for IL-27 in limiting T regulatory cell populations[J]. J Immunol, 2011, 187: 266-273.

9 羅俊華, 吳娜. IL-27、ADA 及INF-γ 在結核性和惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值[J]. 河北醫藥, 2015, 37(4): 512-514.

10 戰玉助, 蔣利萍, 王莉, 等. 白細胞介素-27基因多態性與結核病易感性的關系[J]. 第四軍醫大學學報, 2009, 30(24): 3100-3103.