卡介菌-多糖核酸不同干預方式對哮喘小鼠氣道反應性和氣道炎癥的影響

姜華 賴克方 沈璐 席寅 南巖東 金發光

支氣管哮喘是一種以氣道高反應性、可逆的氣流受阻、氣道嗜酸性粒細胞等浸潤、氣道黏液高分泌及血清高IgE為特征的氣道慢性炎癥性疾病，Th1/Th2失衡學說解釋了哮喘的部分發病機制[1-3]。此后有研究證實調節性T細胞也參與了哮喘的免疫紊亂[4]?？ń槊?bacillus calmette-guerin, BCG)具有很強的Th1細胞作用，多個研究證實在造模前給予BCG干預可明顯降低哮喘小鼠的氣道反應性、氣道炎癥[5-8]?？ń榫嗵呛怂?BCG polysaccharide nucleotide, BCG-PSN)是BCG經過滅活后制成的一種免疫制劑，具有多種免疫活性[9-10]。目前臨床BCG-PSN的用藥途徑為肌肉注射，其缺點是用藥周期長，臨床應用受限，且需在相關動物研究為造模前給藥。因此本研究主要探討BCG-PSN不同方式干預對已造模成功的哮喘小鼠氣道炎癥和氣道反應性的影響。

材料和方法

一、材料及試劑

Balb/c小鼠(購自廣東省實驗動物中心)5～6周齡，體質量16～18 g，雌性。飼養在廣州呼吸疾病研究所SPF級動物房。卵白蛋白(OVA，Sigma公司)，佐劑Al(OH)3(Sigma公司)?？ń榫?多糖核酸購自醫院藥房(國藥準字92S020100，湖南斯奇生物制藥有限公司生產)。小鼠無創肺功能儀(美國Buxco公司)。

二、試驗方法

1. 動物致敏、激發： 以OVA首次致敏為0 d，在0、7、14 d OVA(0.01%OVA，0.2 ml/只)腹腔注射致敏，28、29、30 d(早期)，42、43、44 d(晚期) OVA(0.4%OVA，50 μl/只)滴鼻激發，一次/d。正常組在每次給藥時間點給予相應劑量的生理鹽水。動物造模干預流程，見圖1。

圖1 研究中動物致敏、激發、BCG-PSN干預流程；注：ip腹腔注射致敏20 μg OVA(0.01% OVA,0.2 ml/只)；in麻醉滴鼻激發200 μg OVA(0.4% OVA，50 μl/只)im 肌肉注射

2. BCG干預： 劑量為20 μg/只，體積為60 μl，均為末次激發后(30 d)進行干預，根據干預方式分為肌肉注射組(im)和麻醉滴鼻組(in)。

3. 麻醉滴鼻給藥方式藥物分布檢測： 取10只正常小鼠，分別用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉，將5%伊文思藍溶液50 μl(用NS配制)經鼻滴入，滴完后轉動小鼠體位數次以促進激發液在肺內均勻分布。處死小鼠，分別留取鼻、氣管、食管、肺臟(包括支氣管)、脾臟(陰性對照)，分別加入1 ml甲酰胺溶液，65 ℃水浴24 h，配制伊文思藍標準濃度溶液(156、78、39、19. 5、9.7、4.8、2.4、0 μ/ml)，用酶標儀在600 nm處檢測標準液及各器官組織的吸光度OD值。根據標準曲線換算成各器官伊文思藍濃度。

4. 氣道反應性： 分別在實驗流程的32、46 d，小鼠進行無創肺功能檢測，通過乙酰甲膽堿(Mch)激發測定各濃度時的Penh值，Mch激發濃度包括3.12、6.25、12.5、25、50 mg/ml。以生理鹽水(normal saline, NS)時的Penh值為基值，將各個濃度Penh的百分比(Penh/NS%)，作為氣道反應性統計指標[11-12]。本研究評價氣道反應性包括以下二個方面：①與哮喘組相比可以顯著降低氣道反應性(P<0.05)的激發濃度；②氣道反應性升高為基值2倍時的Mch激發濃度即PC100，值越小，氣道敏感性越高。

5. 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)分析：在實驗流程第46 d，小鼠行無創肺功能檢測后，以100 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，摘眼球放血，仰臥位，行氣管插管，以0.8 ml PBS灌洗3次，回收率在80%以上。4 ℃以離心半徑8 cm，1 500 r/min，離心10 min，沉淀涂片并行HE染色，連續計數200個細胞并計其中Eos的個數，計算Eos百分比。

6. 肺組織學病理： 分離肺臟，通過氣管插管灌注10%中性甲醛使肺膨脹進行內固定，取出肺臟浸入10%中性甲醛中外固定，切取左肺葉，經不同梯度濃度乙醇、二甲苯處理后，石蠟包埋，切片，HE染色并鏡檢。

三、統計學方法

所有數據用均數±標準差表示，各組間比較采用spss13.0進行單因素方差分析，方差齊用最小顯著差異法(least significant difference, LSD)，當方差不齊時用Tamhane′s T2法或采用秩和檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。在造模過程中死亡及感染的動物不列入統計。

結 果

一、麻醉滴鼻給藥方式的藥物分布

結果顯示伊文思藍經麻醉狀態滴鼻后進入體內，主要沉積于支氣管及肺部，的濃度為(43.11±7.68)μg/ml，與脾臟中藥物濃度(2.57±0.65)μg/ml，差異具有統計學意義(P<0.01)，其次是鼻，其濃度為(8.44±2.82)μg/ml，與脾臟相比(P<0.05)，但明顯低于支氣管及肺組織中藥物濃度，主氣管(2.39±0.73)μg/ml與食管(1.96±0.43)μg/ml 中的分布幾乎可以忽略不計，見圖2。

圖2 5%伊文思藍麻醉滴鼻給藥后各個器官分布的濃度(μg/ml)；注：* vs. spleen P<0.05, ** vs. spleen P<0.01

二、氣道反應性

1. Penh/NS%： 對于早期激發，BCG-PSN im組與in組在Mch激發濃度(3.12～50 mg/ml)與哮喘組相比，Penh/NS%均明顯降低，且在12.5、50 mg/ml時in組顯著低于im組，差異有統計學意義(P<0.05)；而對于晚期激發：im組完全不能降低氣道反應性，而in組則在Mch激發濃度為12.5、25、50 mg/ml時，Penh/NS%與哮喘組相比明顯減低，且在激發濃度為25、50 mg/ml時明顯低于im組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、2。

2. PC100： BCG-PSN im組早期PC100為(9.48±3.06)mg/ml、與哮喘組(4.79±1.51)mg/ml相比P<0.05，晚期PC100(4.96±1.88)mg/ml，哮喘組為(5.55±3.11)mg/ml，兩組相比差異無統計學意義，BCG-PSN in組早期、晚期PC100分別為(12.39±4.89)mg/ml、(9.19±2.35)mg/ml，與哮喘組相比，均有統計學意義(P<0.05)，且晚期激發PC100 in組明顯高于im組，見圖3。

圖3 BCG-PSN不同干預方式對哮喘小鼠氣道反應性(PC100)的影響；注：im 肌肉注射組，in 麻醉滴鼻組 *vs. asthmaP<0.05; **vs. asthmaP<0.01；& 兩種干預方式相比P<0.05

表1 BCG-PSN干預對哮喘小鼠在Mch各濃度早期激發氣道阻力(Penh/NS)%的影響

注：與哮喘組比較，aP<0.05，bP<0.01；兩種干預方式比較cP<0.05

表2 BCG-PSN干預對哮喘小鼠在Mch各濃度晚期激發氣道阻力(Penh/NS)%的影響

注：與哮喘組比較，aP<0.05，bP<0.01；兩種干預方式比較cP<0.05

三、氣道炎癥

哮喘組BALF中Eos%為(40.73±6.01)%，明顯高于正常組，BCG-PSN im組Eos% 為(35.65±4.27)%，與哮喘組相比無明顯差異(P>0.05)，BCG-PSN in組(30.98±5.45)%顯著低于哮喘組，差異有統計學差異(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組對哮喘小鼠BALF中Eos%的影響；注：im 肌肉注射組，in 麻醉滴鼻組 *vs. asthmaP<0.05; **vs. asthmaP<0.01

四、肺組織病理變化

正常組小鼠肺組織光鏡下肺泡壁結構完整，肺泡腔內無滲出液，肺泡上皮細胞排列有序，極少有嗜酸性粒細胞及淋巴細胞浸潤。哮喘組肺泡腔內可見巨噬細胞浸潤，氣管壁及血管周圍可見大量的Eos及淋巴細胞浸潤。BCG-PSN干預組與哮喘組相比血管周圍及氣管壁Eos、淋巴細胞浸潤均明顯減少，見圖5。

圖5 肺組織病理圖；注：A：正常組小鼠肺組織學病理(HE×400)；B：哮喘組小鼠肺組織學病理(HE×400)；C：im組小鼠肺組織學病理(HE×400)；D：in組小鼠肺組織學病理(HE×400)

討 論

大量動物實驗證實BCG可以顯著抑制哮喘小鼠的氣道反應性和減輕其氣道炎癥，具體機制包括BCG-PSN多糖及核酸的作用，BCG是經熱酚法去除蛋白后提取的卡介菌多糖核酸，配以滅菌生理鹽水制成的以多糖成分為主的一種非特異免疫調節劑[5-8,13]。前期實驗也證實在致敏前腹腔注射給予卡介菌多糖核酸可對哮喘小鼠產生預防作用[14]。因此本研究旨在探討BCG-PSN不同方式干預對已造模成功的哮喘小鼠氣道炎癥和氣道反應性的影響。

本文結果發現，小鼠經過致敏、激發后具備哮喘動物模型的基本條件：氣道呈高反應性和氣道炎癥，此時給予BCG-PSN干預，肌肉注射和鼻內吸入兩種干預方式均可降低早期激發的小鼠氣道反應性，后者還可顯著降低晚期激發氣道反應性。本研究還證實對于氣道炎癥，肌肉注射干預不能有效的減輕氣道炎癥，而鼻內干預則可顯著地抑制氣道炎癥。與之前的研究采取的干預時機即造模前干預不同，本研究證實對已造模成功的哮喘小鼠進行BCG-PSN干預，仍然可以顯著降低哮喘小鼠的氣道反應性和氣道炎癥[5-8]。Shirota等[15]在氣道內予OVA激發時同時給予CpG-ODN(BCG核酸中的成分)，發現CpG-ODN能顯著抑制OVA介導的氣道炎癥和氣道高反應性，也從動物實驗證實了BCG組分鼻內干預對哮喘小鼠的治療作用。有研究通過臨床觀察研究發現BCG-PSN可通過增加血清中IL-4及IFN-r調節Th1/Th2失衡，從而提高臨床哮喘兒童治療效果[9]。BCG-PSN對哮喘患者具有一定的治療及免疫調節作用，褚明慧[16]、李靖[17]通過研究證實BCG-PSN對咳嗽變異性哮喘患兒、哮喘合并過敏性鼻炎的兒童及成人均有一定的療效，也證實了BCG-PSN對哮喘具有治療作用。

目前臨床BCG-PSN用藥途徑為肌肉注射，且需多次干預，療程為2～3個月，給臨床使用帶來了諸多限制，因此在保留其藥理作用的前提下是否存在更為方便的干預方式，則一直未有研究報道。早在2002年有學者就探討過麻醉后滴鼻這種干預方式，認為BCG經麻醉滴鼻干預可以降低小鼠氣道反應性并減輕氣道炎癥，并發現麻醉后滴鼻干預效果優于腹腔注射[18-19]。Samary等[20]通過與皮下注射相比，發現鼻內給予BCG干預也可通過增加CD4+CD25+T細胞關鍵因子foxp3的表達及刺激IL-10的分泌從而降低哮喘小鼠氣道高反應性，但干預時機為造模前。以上多個研究均證實了鼻內吸入干預是BCG或BCG-DNA的有效的干預方式。本研究發現，對于已造模成功的哮喘小鼠模型，肌肉注射對哮喘小鼠的治療作用僅體現在早期氣道反應性的抑制，而對晚期氣道反應性無抑制作用，而麻醉后滴鼻干預對早期激發和晚期激發的氣道反應性均有明顯抑制，說明麻醉滴鼻比肌肉注射效果更加明顯，作用時間更為持久。此外對于氣道炎癥，肌肉注射組并未降低氣道炎癥，而麻醉滴鼻組明顯減輕了氣道嗜酸性粒細胞的浸潤，與羅光燕等[21]的研究相比，多次給予BCG-PSN干預既可明顯降低氣道反應性，又可減輕氣道炎癥，結果優于臨床上BCG-PSN肌肉注射需要多次給藥，且總的治療周期長的缺點。

對于鼻內干預方式，Choi等[22]發現BCG鼻內干預對哮喘小鼠氣道反應性指標PC100無明顯影響，但該研究是在小鼠清醒的情況下鼻內干預，筆者也曾嘗試在小鼠清醒狀態下滴鼻，觀察到小鼠存在吞咽、打噴嚏動作，可能使部分藥物進入了食管、胃等消化道，并且部分藥物被噴出。曾有研究證實在清醒狀態下小鼠進行滴鼻，發現藥物主要分布于鼻部，而下氣道的藥物分布極少，這些可能都是部分研究中鼻內干預效果欠佳的原因[23-24]。而本研究采取麻醉后滴鼻，利用小鼠自然呼吸使藥物進入呼吸道，并通過伊文思藍證實藥物多數分布于支氣管與肺中，少數分布于鼻，保證了藥物充分作用于哮喘小鼠的呼吸道，可能也是鼻內干預優于肌肉注射干預的原因。此外Gauvreau等[25]發現哮喘患者吸入CpG(未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸)治療后，患者痰和外周血單個核細胞的IFN-γ水平明顯增高，證實臨床上核酸組分吸入干預的可行性，為BCG-PSN經鼻臨床應用提供了依據。

本研究初步證實了BCG-PSN不僅對哮喘小鼠具有預防作用，而且對已造模成功的哮喘小鼠具有治療作用。麻醉滴鼻相當于氣道吸入對哮喘小鼠的作用效果，且與肌肉注射給藥相當甚至更優。但是臨床BCG-PSN通過氣道給藥仍需要更進一步的對其劑型、顆粒大小以及具體吸入方式進行研究。

參 考 文 獻

1 王長征. 支氣管哮喘的動脈血氣和酸堿平衡[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2010, 3(3): 215-221.

2 Lee SH, Park JS, Park CS. The search for genetic variants and epigenetics related to asthma[J]. Allergy Asthma Immunol Res, 2011, 3(4): 236-244.

3 Akinbami LJ, Moorman JE, Liu X. Asthma prevalence, health care use, and mortality: United states,2005-2009[J]. Natl Health Stat Report, 2011, 12(32): 1-14.

4 Kinoshita T, Baatjes A, Smith SG, et al. Natural regulatory T cells in isolated early responders compared with dual responders with allergic asthma[J]. J Allergy Clin Immunol, 2014, 133(3): 696-703.

5 Qu SY, Ou-Yang HF, He YL, et al. Der p2 recombinant bacille Calmette-Guerin priming of bone marrow-derived dendritic cells suppresses Der p2-induced T helper17 function in a mouse model of asthma[J]. Respirology, 2014, 19(1), 122-131.

6 Gouveia ACC, Braga FG, Mota M, et al. Enhanced expression of PD-L1 and IFN-γ on dendritic cells is associated with BCG-induced Th2 inhibition[J]. Cytokine, 2017, 99: 163-172.

7 Spitz C, Winkels H, Bürger C, et al. Regulatory T cells in atherosclerosis: critical immune regulatory function and therapeutic potential[J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73(5): 901-922.

8 Gong P, Li Y, Tan YP, et al. Pretreatment With Inactivated Bacillus Calmette-Guerin Increases CD4+CD25+Regulatory T Cell Function and Decreases Functional and Structural Effects of Asthma Induction in a Rat Asthma Model[J]. Artif Organs, 2016, 40(4): 360-367.

9 Wang HL, Ma N. Effect of BCG-PSN adjuvant therapy on Th1/Th2 immune response in bronchial asthma children[J]. Int J Clin Exp Med, 2016, 9(2): 2555-2560.

10 石濤, 馮學斌, 趙志旭, 等. 卡介苗多糖核酸對哮喘大鼠淋巴液和血液CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的影響[J]. 中國免疫學雜志, 2010, 26(10): 932-936.

11 Han ER, Choi IS, Choi HG, et al. Therapeutic effects of mycobacterial secretory proteins against established asthma in BALB/c mice[J]. Allergy Asthma Immunol Res, 2012, 4(4): 214-221.

12 李斌愷, 賴克方, 洪燕華, 等. 支氣管哮喘小鼠氣道反應性無創檢測方法的建立[J/CD]. 中華哮喘雜志(電子版), 2008, 2(3): 165-169.

13 Zhang G, Wang P, Qiu Z, et al. Distant lymph nodes serve as pools of Th1 cells induced by neonatal BCG vaccination for the prevention of asthma in mice[J]. Allergy, 2013, 68(3): 330-338.

14 姜華, 賴克方, 沈璐, 等. 卡介菌多糖核酸對哮喘小鼠氣道炎癥和氣道反應性的影響[J]. 國際呼吸雜志, 2010, 30(7): 409-413.

15 Shirota H, Sano K, Kikuchi T, et al. Regulation of T-helper type 2 cell and airway eosinophilia by transmucosal coadministration of antigen and oligodeoxynucleotides containing CpG motifs[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2000, 22(2): 176-182.

16 褚明慧. 孟魯司特鈉聯合卡介菌多糖核酸治療小兒變異性哮喘的效果觀察[J]. 中國當代醫藥, 2016, 23(5): 23-25.

17 Li J, Luo DF, Li SY, et al. Efficacy of intramuscular BCG polysaccharide nucleotide on mild to moderate bronchial asthma accompanied with allergic rhinitis: a randomized, double blind, placebo-controlled study[J]. Chin Med J (Engl), 2005, 118(19): 1595-1603.

18 Hopfenspirger MT, Agrawal DK. Airway hyperresponsiveness, late allergic response, and eosinophilia are reversed with mycobacterial antigens in ovalbumin-presensitized mice[J]. J Immunol, 2002, 168(5): 2516-2522.

19 Major T, Wohlleben G, Reibetanz B, et al. Application of heat killed Mycobacterium bovis-BCG into the lung inhibits the development of allergen-induced Th2 responses[J].Vaccine, 2002, 20(11-12): 1532-1540.

20 Samary Cdos S, Antunes MA, Silva JD, et al. Impact of Bacillus Calmette-Guérin Moreau vaccine on lung remodeling in experimental asthma[J]. Respir Physiol Neurobiol, 2013, 189(3): 614-623.

21 羅光燕, 藍楠, 王孝蕓, 等. 卡介菌核酸多糖注射液對哮喘小鼠氣道炎癥和肺部抗菌肽表達影響與機制研究[J/CD]. 中華臨床醫師雜志(電子版), 2013, 21(7): 9633-9637.

22 Choi IS, Lin XH, Koh YA, et al. Inoculation route-dependent and allergen-specific suppressive effects of bacille Calmette-Guerin vaccination on asthmatic reactions in BALB/c mice[J]. Lung, 2007, 185(3): 179-186.

23 McCusker C, Chicoine M, Hamid Q, et al. Site-specific sensitization in a murine model of allergic rhinitis: role of the upper airway in lower airways disease[J]. J Allergy Clin Immunol, 2002, 110(6): 891-898.

24 Cho YS, Kwon B, Lee TH, et al. 4-1 BB stimulation inhibits allergen-specific immunoglobulin E production and airway hyper-reactivity but partially suppresses bronchial eosinophilic inflammation in a mouse asthma model[J]. Clin Exp Allergy, 2006, 36(3): 377-385.

25 Gauvreau GM, Hessel EM, Boulet LP, et al. Immunostimulatory sequences regulate interferon-inducible genes but not allergic airway responses[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2006, 174(1): 15-20.