SAT-MP（RNA）檢測結合影像學檢查在早期支原體肺炎中的診斷價值

白麗梅，董昔山

肺炎支原體（MP）是常見的呼吸道感染病原體，約30%感染者發生肺炎[1]。支原體肺炎無特異性癥狀，臨床醫生很難與其他病原菌感染所致肺炎區分開來[2]。MP檢測技術眾多，包括培養法、血清學抗原抗體檢測等，培養法檢測時間長，對于實驗室要求較高，且容易受到送檢樣本中其他病原菌的干擾；血清MP-IgM一般于感染后1周出現，并且血清學抗原抗體檢測受患者自身免疫水平影響[3]。因此，臨床迫切需求一種快速、準確的MP檢測新方法。RNA恒溫擴增法是（SAT）近年來出現的一種新型的病原體分子診斷技術，是以活菌的特異性RNA基因片段作為擴增對象，具有無創、簡單等優點[4]。本研究對咳嗽、發熱癥狀患者的臨床樣本采用SAT法進行MPRNA檢測，探討SAT-MP（RNA）結合胸部X線檢查在早期支原體肺炎中的診斷價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江新安國際醫院2016年10月至2017年4月收治的咳嗽、發熱癥狀患者463例，其中男241例，女222例；年齡2個月至14歲，中位年齡4.5歲；病程 2 ～ 12 d，平均（4.72±1.82）d。

1.2 儀器及試劑 上海宏石SLAN-96S型實時熒光定量PCR儀，MP核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增）購自上海仁度生物科技有限公司；MP-IgM檢測試劑盒（化學發光法）由深圳亞輝龍公司生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 SAT-MP檢測 使用一次性無菌咽拭子采集入院1 d患者咽部分泌物，將拭子頭放入含1 ml 0.9%氯化鈉注射液的PE管中晃動10 s，貼管壁擠干后丟棄拭子頭。取500 l樣本加入500 l裂解液進行裂解，取裂解后的樣本400 l加入100 l核酸提取液。60℃恒溫5min，室溫放置10min，于磁性分離架放置5min，吸凈管中的液體，洗滌2次。加入40 l擴增液，震蕩5 s，取30 l懸液至新的PCR 管中，60 ℃，10 min；42 ℃，5 min；加入10 l擴增酶，在上海宏石SLAN-96S擴增儀上進行擴增，反應程序為42℃，1min，共40個循環，FAM通道收集熒光信號。讀取每個樣本的RNA擴增循環數（dt值）。陽性和陰性對照同法進行操作。判斷標準：dt值≤35為陽性；dt值≥40為陰性；dt值35～40的樣本重新檢測，dt值≤35為陽性，＞35為陰性。

1.3.2 MP-IgM抗體檢測 分別取患兒入院2d和7～10 d時空腹靜脈血2 ml，2 000 r/ming離心10 min，取血清按照MP-IgM檢測試劑盒說明書檢測。陽性標準：MP-IgM抗體≥1.10 Col。

1.3.3 X線檢查 對SAT-MP檢查陽性的患者行胸部正位X線檢查。

1.4 統計方法 采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計數資料比較采用2檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SAT-MP檢查結果 入院24 h時血清MP-IgM陽性14例（3.02%），經雙份血清MP抗體檢查確診MP感染19例（4.10%），經SAT-MP檢查共發現36例（7.77%）MP感染患者。SAT-MP診斷MP感染的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為36.11%（13/36）、98.59%（421/427）、68.42%（13/19）、94.82%（421/444）。見表 1。

2.2 X線檢查結果 36例SAT-MP檢測陽性患者胸部正位X線檢查，均可見肺炎病變。其中大葉實質浸潤8例，表現為扇形或者三角形大片狀陰影，邊界清晰，左肺3例，右肺3例，雙肺2例；小葉性實質浸潤14例，表現為自肺門向外呈扇形或者放射狀延伸，可見大小不一的陰影，部分病灶融合呈磨玻璃密度，左肺2例，右肺4例，雙肺8例；間質浸潤性14例，表現為肺紋理變粗、增加，可見網狀和點狀陰影，左肺4例，右肺8例，雙肺2例。

3 討論

MP感染是臨床常見的呼吸道感染病原體，支原體肺炎好發于學齡期兒童，以5歲以下居多[4]。MP感染早期肺部體征不明顯，影像學改變比較明顯但具有多樣性，使得醫生難以做出診斷結論。經典培養法培養條件苛刻，檢測周期長不適用于早期診斷。快速培養法易受雜菌影響，特異性不高。血清學中的雙份血清特異性抗體滴度檢測特異性高，但需在患者治療期間采集2次血液進行檢測，抗體的產生需1周左右的時間并且受機體免疫功能的影響較大，降低了臨床診斷效率。MP DNA檢測的靈敏度和特異度均較高[5]。但臨床DNA檢測無法區分MP的攜帶狀態，部分患者感染1個月時其 DNA的檢出率仍然高達50%，MP DNA持續攜帶中位數時間為7周，個別甚至長達7個月之久[6]；另一方面，DNA檢測技術無法區分“活菌”和“死菌”，導致檢測結果和臨床相關性不足。

SAT技術是采用 M-MLV反轉錄酶、T7RNA聚合酶對靶RNA進行恒溫擴增檢測，具有如下優勢[7]：（1）區分“活菌”和“死菌”，靶RNA由活菌產生，一旦病原體死亡，RNA快速降解，因此檢測結果與臨床具有良好的相關性，指導臨床合理用藥，減少無效治療；（2）診斷活動性感染，當病原體處于活動性感染狀態時，RNA轉錄較為活躍，dt值較低，當病原體處于潛伏狀態時，靶RNA不轉錄；（3）防止實驗室污染，由于SAT檢測對象為 RNA，擴增中產生的產物也是RNA，而RNA極易降解，避免了DNA擴增過程中可能造成的實驗室污染問題。本研究顯示，SAT-MP檢測疑似支原體肺炎患者咽拭子中 MP感染的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為36.11%、98.59%、68.42%、94.82%，提示該法檢測 MP的特異度較高。MP抗體檢測入院24h內MP感染陽性率為3.02%（14/463），低于最終確診MP感染19例（4.10%），提示SAT-MP對MP的診斷早于 MP抗體檢測。本研究36例SAT-MP陽性患者進行胸部正位X線檢查顯示，均可見肺部病變，提示SAT-MP與X線檢查結果具有極高的一致性，反映SAT-MP與臨床具有非常高的相關性。

表1 463例患者MP感染情況分析 例

參考文獻：

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[2]黃梅.小兒肺炎支原體肺炎臨床表現及發病機制分析[J].中國婦幼保健,2014,29(2):223-225.

[3]張志英,韓淑娟,張小寧,等.肺炎痰液支原體DNA聯合血清MP-IgM抗體檢測在小兒肺炎支原體肺炎早期診斷中的價值[J].中國臨床新醫學,2017,10(9):866-868.

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[5]Diaz MH,Benitez AJ,Winchell JM.Investigations of Mycoplasma pneumoniae infections in the United States:trends in molecular typing and macrolide resistance from 2006 to 2013[J].Journal of Clinical Microbiology,2015,53(1):124-130.

[6]Li W,Fang Y,Shen H,et al.Evaluation of a real-time method of simultaneous amplification and testing in diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection in children with pneumonia[J].Plos One,2017,12(5):e0177842.

[7]Yamada Y,Doi M,Kamituna M,et al.Two cases of Mycoplasma pneumoniae bronchopneumonia diagnosed with LAMP(loop-mediated isothermal amplification)as arapidassay[J].Kansenshogaku Zasshi the Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases,2014,88(2):160.