FOXK1通過上皮間充質轉化促進胃癌浸潤轉移研究

盧洪勝，於櫻枝，牟櫻紅，潘黎明，曹學全，包衛(wèi)光，章輝

叉頭框（FOX）基因家族為一類轉錄因子家族，共包含43個成員。FOX基因家族1類包括FOXA.G、I-L及Q亞家族，其在碳端有一個基本結構域；而FOXH及FOXM-P則歸屬于FOX基因家族2類。本研究的研究對象為FOX基因家族中的一員－FOXKl，其編碼的蛋白與鼠肌細胞核因子（MNF）/FOXKl有高度的同源性。上皮間充質轉化（EMT）是指具有極性的上皮細胞在一定的生理或病理情況下向具有移行能力的間充質細胞發(fā)生轉化的過程。現代研究發(fā)現，發(fā)生EMT時E-鈣黏素蛋白（E-cadherin）表達減少，而獲得間質細胞特性，如波形蛋白（Vimentin）等蛋白表達上調，細胞黏附能力下降，遷移能力增加，更易于侵襲轉移[1-2]。本研究應用組織芯片及免疫組化技術檢測胃癌組織FOXKl及EMT相關標志物E-cadherin、Vimentin的表達情況，探討其在胃癌中的表達意義。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集浙江省臺州市中心醫(yī)院2013年1月至2017年7月胃癌手術患者88例，其中男58例，女30例；平均年齡（66.26±12.35）歲，≤60歲26例，＞60歲62例；腫瘤直徑≤5cm60例，＞5cm 28例。根據胃癌的不同分化程度和不同分期程度：高分化9例，中分化30例，低分化49例；T分期，T1期9例，T2期12例，T3期2例，T4期65例；N分期，N0期19例，N1期14例，N2期21例，N3期34例；TNM分期，Ⅰ期為10例，Ⅱ期25例，Ⅲ期52例，Ⅳ期1例。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片 采用自主研發(fā)的一次成型組織芯片制作技術制作芯片蠟塊。先對供體蠟塊進行切片并HE染色，顯微鏡下定位，再在供體蠟塊對應位置獲取組織芯，然后將獲得的組織芯按相對正常組織、癌灶組織配對依次排入銅質模具的7×9陣列孔內。每例設兩個重復點，放入65℃烤箱內烤約10min（蠟芯表面微融化），取出后馬上注入65℃的包埋石蠟，然后取出墊片均勻用力按下陣列孔銅板將組織芯頂起。之后，在承蠟槽上放入包埋盒并加滿石蠟，最后將模具放入4℃冰箱或冷空調口快速冷卻，冷卻后即可取出組織芯片蠟塊。以4m厚度連續(xù)切片，敷貼于專用防脫載玻片上。

1.2.2 免疫組化 所用標本經甲醛固定，石蠟包埋組織，經制作芯片后依次切片，其中常規(guī)HE染色1張，免疫組化切片3張，采用EnVision二步法。所用試劑FOXKl抗兔多克隆抗體，購自中山公司，抗體濃度為1∶200，E-cadherin、Vimentin為單克隆抗體，購自福建邁新公司，抗體濃度均為1∶100。

1.2.3 結果判讀 染色結果根據染色強度及陽性表達細胞百分數進行半定量分析，FOXKl以細胞核中見到棕黃色顆粒分布為陽性，E-cadherin、Vimentin分別以細胞膜和漿中見到棕黃色顆粒分布為陽性。染色強度判斷標準為：不著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。陽性細胞百分數判斷標準：每個視野計數100細胞，陽性細胞百分數＜5%為0分，5%～25%記為1分，25%～75%為2分，75%為3分。染色強度分值和陽性細胞百分數分值相乘即為每張染色切片的最終得分，0～1分判為陰性，2～4分低表達組，6～9分為高表達組。

1.3 統計方法 采用SPSS17.0軟件進行分析，計數資料以率表示，采用2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FOXK1在胃癌組織及正常對照中標記結果比較 FOXK1在胃癌組織中表達為96.59%（85/88）（封二彩圖4～5），在正常胃黏膜中表達為7.95%（7/88），胃癌組織中FOXK1表達顯著高于正常胃黏膜（x2=138.56，P ＜ 0.01）。

2.2 FOXK1與胃癌臨床病理特征的關系 FOXK1蛋白表達量在胃癌分化程度、腫瘤T分期、腫瘤N分期、腫瘤TNM分期中差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表 1。

2.3 FOXK1與EMT標記物E-cadherin、Vimentin的相關性 Spearman相關性分析顯示，FOXK1與E-cadherin表達呈負相關（r=－0.21，P＜ 0.05），與Vimentin表達呈正相關（r=0.63，P＜ 0.05）。

3 討論

表1 FOXK1表達與胃癌臨床病理因素及E-cadherin、Vimentin的關系

圖4 組織芯片顯示高分化胃癌HE染色（HE，×100）

圖5 組織芯片顯示FOXK1在中分化胃癌表達（En Vision法，×50）

胃癌是我國第二大高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病率為679.1/10萬人年，僅次于肺癌，且預后差，死亡率高[3]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多方面因素綜合影響下的復雜生物學過程，涉及癌基因的激活、抑癌基因的失活及眾多分子水平上的改變。近年來，隨著診療技術的進步，早期胃癌患者5年生存率已顯著提高，但伴有淋巴結轉移或遠處轉移的胃癌患者預后仍然沒有明顯改善，成為死亡率高的重要原因。由此可見，胃癌進展已經成為影響胃癌患者的療效及獲得長期生存的關鍵問題。

FOX基因參與腫瘤多種惡性生物學表型的調控，FOXK1為其中一員，屬于轉錄因子。近年來陸續(xù)有研究報道，Okada等[4]研究發(fā)現，FOXM1通過誘導VEGF生成，進一步促使胃癌中血管形成而至進展；Wang等[5]研究表明，FOXK1和FOXK2通過Wnt/-catenin信號系統將DVL轉移到細胞核，導致腫瘤惡性程度增加；Xie等[6]發(fā)現FOXK1在RUFY3過表達細胞株里逆轉EMT過程，表明RUFY3-FOXK1軸在腸癌的浸潤轉移中起重要作用。本研究發(fā)現FOXK1在胃癌組織中的表達水平遠遠高于正常胃黏膜，且分化程度越低，以及T分期、N分期、TNM分期越高，FOXK1蛋白表達量越高，這表明FOXK1介導了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。對于FOXK1介導的機制也做了初步探究和分析，由于EMT過程伴隨著E-cadherin蛋白表達量減低及 Vimentin表達的增加，促進腫瘤細胞的遷徙和轉移[7]。筆者進一步做FOXK1與EMT相關性研究，結果為FOXK1高表達顯示上皮細胞標志物E-cadherin表達下調，間質細胞標志Vimentin表達上升，表明FOXK1過表達促進了胃癌細胞的EMT，引起胃癌浸潤轉移。

終上所述，FOXK1檢測有助于評估胃癌的生物學行為和預后，初步表明通過介導EMT促進胃癌浸潤和轉移，但需要進一步細胞學和動物實驗加以驗證。

參考文獻：

[1]PinoMS, Kikuchi H,Zeng M,et a1.Epithelial to mesenchymal transition is impaired in colon cancer cells with microsatellite instability[J].Gastroenterology,2010,138(4):1406-1417．

[2]Kalluri R,Weinberg RA.The basics of epithelial-mesenchymal transition[J].J Clin Invest,2009,119(6):1420-1428．

[3]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancerstatistics in China,2015[J].CA Cancer Journal for Clinicians,2016,66(2):115.

[4]Okada K,Fujiwara Y,Takahashi T,et al.Over expression of forkhead box M1transcription factor(FOXM1)is a potential prognostic marker and enhances chemoresistance for docetaxel in gastric cancer[J].Annals of Surgical Oncology An Oncology Journal for Surgeons,2013,20(3):1035-1043.

[5]Wang W,Li X,Lee M,et al.FOXKs promote Wnt/-catenin signaling by translocating DVL into the nucleus[J].DevCell,2015,32(6):707-718.

[6]Xie R,Wang J,Liu X,et al.RUFY3 interaction with FOXK1 pro motes invasion and metastasis in colorectal cancer[J].Sci Rep,2017,7(1):3709.

[7]He C,Wang Z,Zhang L,et al.A hydrophobic residue in the TALE homeodomain of PBX1 promotes epithelial-to-mesenchymal transition of gastric carcinoma[J].Oncotarget,2017,8(29):46818-46833.