Skp2、p27和Ki-67在乳腺癌中的表達及意義

劉慶猛 李美平 吳滿武 石 丹 譚衛(wèi)峰

1.紹興第二醫(yī)院病理科，浙江紹興 312000；2.紹興市婦幼保健院病理科，浙江紹興 312000；3.紹興市婦幼保健院遺傳室，浙江紹興 312000

泛素-蛋白酶體途徑（Ubiqutin-proteasome pathway）是細胞周期調控的重要途徑之一，其作用機制通過信號傳導通路控制、蛋白酶活性調節(jié)等方式，調控某些癌基因和抑癌基因的活性，調節(jié)細胞周期轉錄因子的表達，從而影響細胞周期進程，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[1]。p27作為一種細胞周期蛋白激酶抑制劑，通過競爭性結合Cyclin-CDK復合物的受體位點，抑制Cyclin-CDK復合物的活性，參與細胞周期調控過程，被認為是一種抑癌基因，在乳腺癌中p27呈低表達,與乳腺癌侵襲、轉移有關，p27失表達提示預后不良[2,3]。S期激酶相關蛋白2（S-phase kinase associated protein 2，Skp2）可通過泛素-蛋白酶體途徑，降解多種參與細胞周期調控因子，Skp2過度表達時，通過磷酸化降解p27功能區(qū)，使其失去細胞周期調控功能，細胞過度增殖，導致腫瘤的發(fā)生[4,5]。Ki-67增殖指數(shù)高低與許多腫瘤預后密切相關，在乳腺癌分子分型和個體化治療方案制定中具有重要意義，Ki-67指數(shù)可作為腫瘤復發(fā)和預后評估有價值的免疫標記[6]。Skp2、p27表達異常與多種腫瘤的發(fā)生有關，Ki-67指數(shù)在腫瘤的分級、分子分型與預后判斷中越來越受到重視，有關Ki-67指數(shù)與Skp2、p27表達異常的關系在乳腺癌中的研究國內罕見報道，我們采用組織芯片技術和免疫組織化學方法檢測乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表達情況，探討三者在乳腺癌中表達的意義及相互關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年3月～2016年10月期間我院收治的80例乳腺癌病例，均為女性患者，年齡32～78歲，平均（52.18±11.79）歲。所有患者術前均未進行化療和放療。病理組織學類型：浸潤性癌68例，原位癌12例，其中浸潤性導管癌，非特殊型42例，浸潤性小葉癌12例，特殊類型浸潤性癌14例（黏液癌7例，小管癌4例，實性乳頭狀癌3例），導管原位癌8例，小葉原位癌4例。腋窩淋巴結狀態(tài)：陽性43例，陰性37例。所有標本均經過10%中性福爾馬林充分固定，固定時間24～36 h，石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 待測80例乳腺癌組織芯片蠟塊的制備[7]第一步：組織芯片空白蠟塊制作：組織芯片儀制作10×8點陣的蠟模，大小約 3.0 cm×2.0 cm，厚度約0.6 cm，預熱后用打孔儀打孔，即制成含80個點陣空白蠟塊。第二步：組織芯片蠟塊制作過程：先將研究樣本蠟塊放入50℃恒溫箱中烘烤15 min左右預熱，再將蠟塊對應的HE切片于顯微鏡下觀察，選定腫瘤組織位置后，蠟塊上進行定位標記，空心穿刺針鉆取目標腫瘤組織區(qū)域，逐一轉移至空白蠟塊相應的孔位內填實并壓緊，待全部芯片位點組織填滿后，最后對含乳腺癌組織芯片的蠟塊進行二次包埋，待自然冷卻，再放入60℃恒溫箱內烘烤30 min后取出，即完成80例乳腺癌組織芯片蠟塊的制備。

1.2.2 采用組織芯片免疫組化檢測Skp2、p27和Ki-67蛋白的表達 本實驗所需免疫組化檢測試劑及試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司，免疫組化染色儀為賽墨飛Labvision Autostainer 480s，采用MaxvisionTM3二步法進行免疫組化染色。乳腺癌組織芯片蠟塊4～5 μm厚切白片，裱于防脫粘附載玻片，經過常規(guī)烤片、脫蠟、水化，EDTA抗原修復，染色過程由免疫組化染色儀完成，DAB顯色，根據(jù)鏡下觀察染色效果控制顯色時間，蘇木素復染，脫水、透明、封片。以已知陽性組織作實驗陽性外對照，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，同時以手工染色作為免疫組化儀對照組，每個免疫組化酶標應用兩張芯片標記，兩份芯片檢測實驗結果比對。

1.3 結果判斷

染色陽性信號呈棕黃色顆粒，陽性定位于細胞核為主。根據(jù)組織芯片排列的點陣，按順序記錄每一個芯片位點的免疫組化染色結果，逐一計算每個組織芯片位點中乳腺癌腫瘤細胞陽性細胞數(shù)占比。以陽性對照組織免疫組化染色陽性結果可靠作為有效判讀前提，Skp2和p27的判讀標準：腫瘤陽性細胞數(shù)＜1%為陰性（－）；≥1%腫瘤陽性細胞數(shù)且<25%者為陽性（+）；腫瘤陽性細胞數(shù)≥25%者為強陽性（++）[8]。Ki-67的判讀標準：腫瘤陽性細胞數(shù)<14%者為低表達組（low）；腫瘤陽性細胞數(shù)≥14%者為高表達組（high）[9]。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，Skp2、p27、Ki-67表達的計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，三者相關性采用Spearman相關檢驗，相關系數(shù)以r表示。

2 結果

2.1 乳腺癌組織芯片免疫組化檢測結果

Skp2、p27和Ki-67免疫組化染色陽性定位于細胞核，呈棕黃色顆粒，如封三圖3～5所示，光鏡下觀察，免疫組化染色×200倍。

2.2 不同組織學類型乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表達

80例不同組織學類型乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表達情況見表1，實驗結果顯示乳腺浸潤性癌中Skp2表達顯著高于原位癌，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=5.83，P<0.05），浸潤性癌中 p27表達低于原位癌（χ2=7.86，P<0.01），浸潤性癌中Ki-67表達顯著高于原位癌（χ2=9.17，P<0.01）。 但 Skp2、p27 和 Ki-67 的表達在浸潤性乳腺癌不同組織學類型中差異均無顯著統(tǒng)計學意義（P>0.05）。直線回歸相關性檢驗結果表明，乳腺癌的侵襲浸潤與Skp2表達增高正相關（r=0.29），與p27失表達負相關（r=-0.31），與Ki-67表達增高正相關（r=0.34）。

2.3 不同腋窩淋巴結轉移狀態(tài)Skp2、p27和Ki-67的表達

乳腺癌不同腋窩淋巴結轉移狀態(tài)中Skp2、p27和Ki-67的表達見表2，實驗結果發(fā)現(xiàn)腋窩淋巴結陽性組Skp2表達顯著高于陰性組，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=28.56，P<0.01），腋窩淋巴結陽性組 p27 表達低于陰性組（χ2=22.18，P<0.01），腋窩淋巴結陽性組 Ki-67高表達率顯著高于陰性組（χ2=33.47，P<0.01）。直線回歸相關性檢驗顯示，乳腺癌的腋窩淋巴結轉移與Skp2表達增高正相關（r=0.58），與p27失表達負相關（r=-0.53），與 Ki-67 表達增高正相關（r=0.68）。

2.4 Skp2、p27和Ki-67三者表達之間的相關性

乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67三者表達之間的相關性見表3和表4，數(shù)據(jù)顯示Skp2在p27陽性乳腺癌中陽性率為19.4%，而在p27陰性乳腺癌中陽性率為68.2%，差異具有顯著統(tǒng)計學意義 (χ2=20.79，P<0.01)。Ki-67在p27陽性乳腺癌中檢測到高表達7例，低表達29例，而在p27陰性乳腺癌中檢測到高表達38例，低表達6例，二者具有顯著性差異 （χ2=34.86，P<0.01）。Ki-67在Skp2陽性乳腺癌中檢測到高表達29例，低表達8例，而在Skp2陰性乳腺癌中檢測到高表達16例，低表達27例，二者具有顯著性差異（χ2=16.80，P<0.01）。直線回歸相關性檢驗結果顯示乳腺癌中Skp2的高表達與p27的失表達呈負相關性（r=-0.56），p27失表達與Ki-67的高表達呈負相關性（r=-0.63）。Skp2與Ki-67的表達之間呈正相關性（r=0.48）。

表3 乳腺癌中p27、Skp2和Ki-67表達的相關性

表4 乳腺癌中Skp2與Ki-67表達的相關性

3 討論

S期激酶相關蛋白-2（Skp2）是DNA復制所必需的人類F-box蛋白家族中的一員。Skp2參與正常細胞增殖調節(jié)，另外，Skp2還參與轉錄調控。Skp2通過泛素蛋白酶水解轉錄因子而發(fā)揮作用，并可促進cmyc誘導的S期轉變和活化c-myc的靶基因。研究表明，Skp2在乳腺癌中表達增高，提示Skp2的異常表達與乳腺癌的發(fā)生關系密切[10-12]。p27作為一個細胞周期負性調控因子，通過兩條途徑發(fā)揮作用：抑制CDK激活及激活后的Cyclin-CDK復合物的活性。另外，p27可增強細胞間的粘附，還可誘導、促進細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，當Skp2過度表達時，p27被過度磷酸化降解，p27失活后喪失其細胞周期調控作用，細胞增殖無限制進行，導致腫瘤的發(fā)生。因此，Skp2、p27Kip1異常表達與乳腺癌的發(fā)生密切相關[13-15]。本組實驗顯示Skp2在乳腺浸潤性癌中的表達顯著高于原位癌，提示Skp2的表達與乳腺癌的浸潤侵襲有一定關系。腋窩淋巴結陽性組顯著高于陰性組，實驗結果表明Skp2的高表達還與乳腺癌腋窩淋巴結轉移密切相關。

p27蛋白缺失或低表達在惡性腫瘤中是一個較為普遍的現(xiàn)象，且低表達預示不良結局。p27通過競爭性結合Cyclin-CDK復合物的受體位點，抑制Cyclin-CDK復合物的活性，參與細胞周期調控過程，p27水平的下降會加速細胞周期G1期的進展，促進細胞不斷增殖，p27除通過影響細胞增殖和凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用外，還參與了細胞分化過程，因此它的水平高低與腫瘤的惡性程度有關，研究報道p27水平越低預示著腫瘤預后越差[16,17]。本組實驗結果表明，p27在浸潤性乳腺癌中顯著低于原位癌，且與Skp2高表達有相關性，二者共同參與乳腺癌的浸潤進展過程。腋窩淋巴結陽性組中p27的表達顯著低于陰性組，提示p27的低表達與乳腺癌腋窩淋巴結轉移有關。

表1 不同組織學類型乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表達

表2 乳腺癌不同腋窩淋巴結轉移狀態(tài)Skp2、p27和Ki-67的表達

Ki-67增殖指數(shù)高低與許多腫瘤預后密切相關，在乳腺癌分子分型中Ki-67指數(shù)意義重大，2011版專家共識將Ki-67指數(shù)14%作為臨界值進行Luminal A和Luminal B型區(qū)分的重要依據(jù)[9]。Ki-67指數(shù)在多種腫瘤的分級分期和預后評估中具有重要意義，大量研究結果表明，Ki-67指數(shù)可作為乳腺癌預后和療效評估有價值的免疫標記[18-27]。本組實驗結果顯示，Ki-67在浸潤性乳腺癌中的表達顯著高于原位癌，腋窩淋巴結陽性組的表達顯著高于陰性組，表明Ki-67的高表達率與乳腺癌的浸潤進展程度和淋巴結轉移密切相關。本組實驗結果顯示Skp2與Ki-67的表達之間呈正相關，p27與Ki-67的表達之間呈負相關。提示在乳腺癌細胞增殖調控機制中，p27具有阻止細胞周期進程的作用，從而抑制細胞增殖，而Skp2發(fā)揮著降解細胞周期調控因子p27，促進細胞增殖的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，Skp2、p27和Ki-67在乳腺浸潤性癌不同組織學類型中表達雖然存在一定差異，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），分析其原因，可能與特殊類型浸潤性癌的樣本數(shù)太少有關，還有待于大樣本研究證實。1998年Kononen等[22]成功構建組織芯片技術后，組織芯片以其高通量、高效性和低成本的技術優(yōu)勢得到廣泛應用，特別在大樣本的研究中具有顯著優(yōu)勢。筆者應用組織芯片技術進行免疫組化檢測積累豐富的經驗，并成功地運用組織芯片進行熒光原位雜交（FISH）檢測，實驗結果與傳統(tǒng)切片檢測相符合[7]。本研究采用組織芯片對80例乳腺組織進行免疫組化檢測，每個免疫酶標各備用一張芯片，僅用六張芯片組織即完成全部檢測需要，極大地降低研究成本，同一免疫酶標兩張芯片的檢測結果還可以相互比對，實驗結果更客觀、可靠，應用組織芯片進行大樣本的免疫組化研究具有高效、經濟的優(yōu)勢。

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