邵峰：從天然免疫到癌癥，細胞焦亡扮演何種角色？

文/《中國醫藥科學》記者 費 菲

2015年12月7日，43歲的獨立研究者邵峰當選中國科學院生命科學和醫學學部院士，刷新了我國兩院院士年齡榜，是1600多名院士中最年輕的一位。

1996年邵峰畢業于北京大學技術物理系應用化學專業，1999年中科院生物物理所碩士畢業，2003年獲得美國密歇根大學醫學院博士學位，2005年在哈佛大學醫學院完成博士后訓練后回國，在北京生命科學研究所創建實驗室，帶領團隊開展獨立研究生涯，在“細胞焦亡”領域做出了許多重要的開創性工作?；貒埃鄯逶谑澜珥敿墝W術期刊《細胞》（cell）和《科學》（science）雜志上分別發表了1篇論文。2005年回國后至今以通訊作者身份在《自然》（nature）、science、cell共發表論文11篇，研究成果多次獲權威專家和學術雜志重點評述。目前邵峰實驗室的研究繼續保持著高水準，每一個成果都吸引了全球大量研究者的目光。

2013年，邵峰院士作為首位大陸本土科學家榮獲國際蛋白質學會頒發的鄂文·西格青年科學家獎。2015年，他成為歐洲分子生物學組織（EMBO）外籍成員，此前只有5位中國科學家獲選。他還曾先后榮獲霍華德·休斯研究所青年科學家獎、吳階平—保羅·楊森醫學藥學獎、周光召杰出青年基礎科學獎和國家杰出青年基金。截至目前，邵峰實驗室已發表學術論文70多篇，同行引用6000多次。

2017年，擔任北京生命科學研究所（NIBS）學術副所長、資深研究員的邵峰院士帶領團隊首次揭示和闡明了細胞焦亡的機制。他們的研究結果顯示，在細胞焦亡的發生機制中，半胱天冬酶（caspase）炎癥小體下游的Gasdermin家族蛋白可能發揮了關鍵作用。

在2017年中國免疫學會年會上，邵峰院士深入淺出地闡述了細胞焦亡對人體免疫系統和癌癥發病的相關機制。

他們在體外試驗將小鼠骨髓誘導的巨噬細胞感染沙門氏桿菌（胞內菌）或痢疾桿菌（胞內自由生存的革蘭氏陰性菌），同時將白細胞介素-1β（IL-1β）和染料加入培養基。感染后染料進入細胞核，免疫熒光顯微鏡觀察到整個細胞發生爆炸性、裂解性死亡，這就是細胞焦亡（pyroptosis）。這一現象早在1992年就被觀察到了，Nature雜志刊登了Zychlinsky A等的文章《弗氏志賀氏桿菌誘導感染的巨噬細胞凋亡》（Shigella flexneri induces apoptosis in infected macrophages），指出弗氏志賀氏桿菌可以誘導感染的宿主巨噬細胞發生程序性死亡。當時對程序性細胞死亡方式的認識僅限于凋亡，因此將其歸結為細胞凋亡作用，這種認識是錯誤的。幾年后的研究發現這種細胞死亡過程需要依賴半胱天冬酶-1（caspase-1）且伴隨炎癥發生，導致在2000年前后大家誤將細胞凋亡和半胱氨酸蛋白酶 （caspase） 家族聯系起來。但顯然這一結論并不正確。這一細胞持續性死亡會發生細胞膜破裂，而細胞凋亡的細胞膜是不破裂的。 在20世紀90年代,人們對這種新的細胞死亡方式的性質不甚理解，并在較長時間內與細胞凋亡相混淆。

□邵峰教授在實驗室

炎性caspase-1是怎么激活的？2002年瑞士Tschopp研究小組首次提出了炎癥小體（Inflammasome）的概念，雖然沒有提出實驗證據。邵峰實驗室的研究認為，炎癥小體復合物能夠激活胱冬肽酶-1（caspase-1），促進炎性細胞因子前體白介素-1（IL-1Lβ）和白介素-18（IL-18）切割成熟，同時激活的Caspase-1還可以使細胞發生焦亡。炎癥小體在過去十幾年里成為天然免疫領域最受關注的熱點問題。各類炎癥小體的區別在于不同的NLR 蛋白可以感受細胞內病原或危險信號的感染。其實當時沒有實驗證據存在炎癥小體的復合物，更多是一種概念的提法，但確實有些疾病的證據支持這一說法，因為很多NLR家族基因的突變會導致一些自身炎癥性疾?。ˋIDs）或自身免疫病。自身炎癥性疾病主要是天然免疫系統發生問題，導致白介素-1（IL-1）活化。自身免疫病則是刺激人體免疫系統產生攻擊自身的抗體。

邵峰院士介紹，我們實驗室最早時探究NLR蛋白是怎么識別和清除細胞內的病原細菌。天然免疫反應的第一步是通過感知蛋白（受體蛋白）最先感知到細菌的入侵，此前對受體蛋白的研究主要集中在細胞膜上的一類天然免疫受體，因此，我們致力于發現宿主細胞質中感知細菌和病原細菌的感知蛋白（受體蛋白）的分子免疫機制，細菌內毒素（即脂多糖，LPS）被識別及其誘導炎癥性壞死的機制是什么？我們創建了一種能將細菌內毒素（即脂多糖，LPS）高效導入哺乳動物細胞內的轉染方法，發現LPS的胞內天然免疫受體是炎癥性半胱天冬酶（caspase），并找到了全新的識別細菌主要模式分子的天然免疫受體（感知蛋白）NAIPs、Pyrin。其中，NAIPs蛋白可作為炎癥小體的受體，識別細胞內細菌的鞭毛素蛋白和內毒素分泌系統的結構成分。Pyrin蛋白的主要功能是間接感知各種細菌毒力的作用，胞內的Rho家族小G蛋白修飾和失活導致肌動蛋白細胞骨架發生紊亂，進而活化經典炎癥小體通路中的caspase-1。

20世紀90年代，Bruce Beutler等鑒定出Toll樣受體4（TLR4）為細胞外的LPS的膜上受體，LPS結合TLR4后誘導細胞因子和炎癥因子轉錄。邵峰由此產生了一個疑問：在細胞質里是否有受體蛋白來識別病原菌最為重要的模式分子LPS？兩年前，邵峰實驗室發現了一個炎癥性Caspase家族，人細胞中的Caspase-4、Caspase-5是小鼠非經典炎癥小體通路中Caspase-11的同源蛋白。與caspase-1類似的caspase-11可直接作為小鼠胞內受體識別革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS），同時可誘導細胞焦亡的發生。

Toll樣受體家族（NLRs）基因的突變還會導致自身炎癥性疾病或自身免疫性疾病，這里面存在因果關系。比如NLR3基因突變可導致痛風、NLRP3突變可導致家族性寒冷性自身炎癥綜合征（FCAS）和穆一韋二氏綜合征（MWS）、慢性嬰兒神經皮膚關節綜合征（CINCA）/NOMID（新生兒多系統炎癥性疾?。LRC4激活的炎癥小體突變可導致小腸結腸炎綜合征和自身炎癥（syndrome of enterocolitis and autoinflammation），也可導致自身免疫性疾病——復發性巨噬細胞活化綜合征（recurrent macrophage activation syndrome）。MEFV基因編碼的Pyrin功能獲得性突變可導致自身炎癥性疾病——家族性地中海熱（FMF）。感知蛋白NAIPs、Pyrin的正常功能是什么？就是識別細菌的結構成分——脂多糖、鞭毛素蛋白。基因突變就是在未感染細菌時已被激活，從而導致各種疾病。這些炎癥小體的基因突變會導致自身炎癥性疾病，在自身免疫病發生中也起到輔助性作用。

細胞焦亡的“促成者”——GSDMD蛋白

細胞焦亡（pyroptosis）與細胞凋亡（apoptosis）究竟有什么差別？小鼠的巨噬細胞發生細胞凋亡時，細胞膜驟縮內陷裂成由細胞膜包裹的一個個泡狀小體（即凋亡小體），凋亡小體表面有特殊信號導致其很快被巨噬細胞或鄰近細胞識別并吞噬，不釋放細胞內容物，因此不會導致組織水平的損傷和炎癥反應，細胞的這種干凈死亡（clean death）方式不影響其他細胞的正常功能。細胞焦亡是細胞體積不斷脹大至細胞膜破裂，釋放細胞內容物從而激活強烈的炎癥反應，屬于一種細胞炎性壞死（dirty death方式）。caspase-1/11都是在天然免疫的下游感知病原細菌的感染。caspase-1/11導致細胞焦亡發生的機制是什么？2015年，邵峰研究組運用全基因組編輯技術篩選人類基因組中的近2.2萬個基因后，成功識別出一個新的基因——導致細胞焦亡的關鍵蛋白GSDMD并闡述了相關機制。GSDMD是所有炎性caspase的共有底物，其編碼的蛋白質大約有500多個氨基酸和2個結構域氨基端gasdermin-N和羧基端gasdermin-C。正常狀態下兩個結構域相互“勾連”作用，處于無活性的自抑制狀態，當炎性caspase-1或caspase-11活化后，可特異性切割GSDMD蛋白2個結構域之間的連接區域，釋放的N端結構域可識別并結合細胞膜上的磷脂類分子，在細胞膜上打孔，導致細胞滲透壓變化，細胞膜脹大裂解引發細胞焦亡。

細胞凋亡（左圖）和細胞焦亡（右圖）

由此可知，GSDMD蛋白與細胞焦亡密切相關，GSDMD蛋白是caspase-1和caspase-11/4/5誘導細胞焦亡的執行者，也清楚地闡述了細胞焦亡的本質是細胞炎性壞死。如果在細胞中去除GSDMD蛋白，細胞便不再發生細胞焦亡。長期以來人們都不甚清楚白細胞介素-1β（IL-1β）釋放至細胞外的機制，邵峰團隊的研究指出，GSDMD蛋白的缺失不會抑制激活caspase-1和對下游白介素1β的切割。在敲除GSDMD的細胞中，白細胞介素-1β可以被caspase-1切割成熟，但切割后成熟的白介素1β卻幾乎不能分泌到細胞外，顯示細胞焦亡對于白介素1β的分泌必不可少，IL-1β不是通過分泌信號釋放到細胞外，而是GSDMD在細胞膜上打孔后排出，GSDMD可能是IL-1β排出細胞外的必要條件。敲除GSDMD基因可以阻止白介素-1β的分泌和炎癥小體及細菌LPS引起的細胞焦亡，使細胞轉而發生凋亡。

caspase參與的炎癥反應及細胞焦亡能有效提高機體抵抗內源性和外源性刺激的能力, 達到保護宿主的目的。caspase-1 和caspase-4/5/11介導的細胞焦亡通路具有天然免疫功能,當宿主細胞發生感染時可識別細菌鞭毛素蛋白、LPS，激活炎癥小體介導的抗細菌天然免疫反應，當病原被天然免疫系統識別后啟動焦亡。因此，將天然免疫受體基因敲除的小鼠無法清除感染的細菌而死亡，而正常野生型小鼠可以清除革蘭氏陰性菌的感染而得以存活。實驗中觀察到，敲除GSDMD基因的小鼠脾臟和肝臟中，可以發現大量細菌的復制和病變。

另一方面，天然免疫系統也是雙刃劍，細胞焦亡通路的過度活化也會引起負面反應。邵峰教授指出，革蘭氏陰性菌導致的膿毒癥是過度的細胞焦亡導致的。在小鼠模型注射大量LPS，它會在一天內死亡；如果把小鼠胞內受體caspase-11或下游的GSDMD敲除則可以存活。實驗室還制作了一個抗體，只識別切割后的GSDMD蛋白，現在需要臨床樣本來驗證這一抗體，有興趣的臨床醫生可以與實驗室取得聯系。GSDMD蛋白是被caspase一分為二，一旦切割成功，細胞一定會發生凋亡。

邵峰實驗室進一步研究發現，GSDMD代表了一個被稱為gasdermin的家族性蛋白，除GSDMD外，GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME（此 前 稱DFNA5）、DFNB59等都具有N端和C端2個結構域，并能被炎性caspase切割。Gasdermin的家族蛋白中，僅GSDMD的2個結構域中間有caspase-1和-11的切割位點，但所有gasdermin家族性蛋白N端結構域被活化后都可在細胞膜上打孔從而誘導細胞焦亡。和GSDMD類似，未感染時這些蛋白N端和C端通過自抑制作用保持無活性狀態。正因為此，邵峰團隊最近將細胞焦亡重新定義為 “由Gasdermin家族蛋白介導的程序性細胞壞死”。由于GSDMD與炎癥小體信號通路重要分子caspase-1和caspase-11/4/5相關，但其他Gasdermin家族蛋白與其無關，需要通過其他機制被切割活化，但最終也會通過啟動細胞焦亡激活天然免疫反應。

邵峰實驗室又在細胞焦亡研究領域取得了新的突破，揭示了另一種Gasdermin家族蛋白GSDME引起細胞焦亡的機制，研究結果已在線發表在2017年5月1日Nature雜志上。一組將實驗用增殖表皮癌細胞（Hela Cells）中敲除GSDMD蛋白,回補GSDMD+腫瘤壞死因子a（TNFa），細胞遂發生了凋亡。另一組將Hela細胞的GSDMD敲除，回補一個改造過的可以被caspase-3切割活化的GSDMD（在兩個結構域中間的caspase-1/4/11切割位點突變為caspase-3的切割位點，由于腫瘤壞死因子a誘導細胞凋亡是通過活化caspase-3），細胞從凋亡轉化為焦亡，說明GSDMD蛋白只要在兩個結構域中切割就會誘導細胞凋亡，這一發現對癌癥治療（尤其是化療）的研發具有重要的指導意義。實驗也說明細胞焦亡比細胞凋亡發生得更快。在第一組實驗中可以觀察到caspase-3切割活化的GSDMD，但另一組實驗卻觀察不到caspase-3活化的GSDMD形態，這是由于焦亡發展得太快，掩蓋了這一激活的過程，即細胞來不及凋亡就發生了焦亡。

邵峰實驗室還完成了Gasdermin家族所有蛋白的對照實驗。此前將GSDMD的caspase-1/4/11切割位點突變為caspase-3切割位點，可以中止TNFa誘導活化caspase-3引起的HeLa細胞凋亡，并轉換為焦亡。在對照實驗中，HeLa細胞中表達野生型的GSDME也同樣可以將凋亡轉換為焦亡，這是為什么呢？通過分析蛋白序列后發現，GSDME的N端和C端結構域中間存在天然的caspase-3切割位點。將caspase-3切割位點D突變為A，可以抑制caspase-3切割N端和C端結構域,細胞則恢復凋亡信號，不再發生焦亡。通過蛋白印跡實驗（Westren Blot）中也證實，如果把caspase-3敲除或把切割位點D突變，就不能再切割N端和C端結構域，細胞焦亡也就不會發生。

另外一個有趣的現象是，腫瘤壞死因子a誘導細胞凋亡是通過活化caspase-3實現的，而caspase-3可以通過多種機制被活化。最經典的caspase-3活化機制是DNA損傷通過線粒體釋放凋亡誘導因子，參與激活caspase-3?；熕幬镯樸K等都會通過損傷DNA導致caspase-3活化。和GSDMD類似，caspase-3切割釋放的GSDME的N端片段，能特異性結合4,5-二磷酸磷脂酰肌醇[PI（4,5）P2]并導致含有該磷脂的脂質體泄漏，負染電鏡結果顯示切割活化的GSDME可以在脂質體膜上打孔。這些結果說明GSDME是由caspase-3切割后活化，進而在膜上打孔并觸發細胞焦亡。教科書上說caspase-3細胞凋亡，本質上是細胞炎性壞死。絕大多數常用的（癌）細胞系均不表達GSDME蛋白，所以被觀察到的細胞確實是發生了凋亡。

邵峰實驗室只找到了兩株癌細胞表達高水平的內源GSDME——人的神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y和惡性黑色素瘤細胞MeWo。把GSDME表達和不表達的細胞用化療藥物處理后，不表達GSDME的細胞用各種損傷DNA的化療藥物誘導后均發生了凋亡，而所有高表達GSDME的細胞都發生了焦亡。進一步檢測了NCI-60（在培養基中生長的標準60種人類癌細胞系）的全部60株癌細胞后，邵峰實驗室研究者發現，大多數的細胞不表達或低表達GSDME,僅有4～5個細胞表達較高水平的GSDME。查找現有文獻發現，GSDME基因的啟動子在癌化過程會發生DNA甲基化，導致表觀遺傳沉默。邵峰實驗室于是做了一個很有意思的實驗。不表達GSDME的癌細胞用地西他濱（目前唯一獲準上市的DNA甲基化轉移酶抑制劑地西他濱，可阻斷DNA甲基化過程）處理后，成功誘導GSDME表達，此時再用傳統化療藥物治療，癌細胞對傳統化療藥物變得更敏感（焦亡關鍵因子GSDME表達），更易發生炎性壞死。

很多臨床醫師開展的實驗證明，地西他濱與傳統化療藥物結合用于治療骨髓增生異常綜合征（MDS）效果更好，但找不到其中的機制。邵峰實驗室的這項研究結果恰好解釋了這一機制。小鼠的很多正常組織器官高表達GSDME，而癌化的細胞由于DNA甲基化介導的表觀遺傳沉默對焦亡關鍵因子GSDME不表達，使用地西他濱后激活caspase-3后誘導GSDME表達，從而促使癌細胞發生GSDME依賴的焦亡。

邵峰實驗室進一步檢測了5株人體正常組織來源的原代細胞血管內皮細胞，除2株不表達GSDME，另外3株高表達GSDME。經化療藥物處理這3株原代細胞后，GSDME高表達的細胞伴隨caspase-3依賴的GSDME切割，發生焦亡；不表達GSDME的2株原代細胞則發生凋亡。在GSDME高表達的原代細胞中，用RNA干擾（RNAi）敲低GSDME表達后，化療藥物引起的細胞焦亡則轉換為凋亡。

癌癥患者使用化療藥物后為何會產生很大的毒副作用？因為在使用化療藥物后，正常原代細胞可高表達焦亡因子GSDME從而誘導焦亡，而癌細胞表觀遺傳沉默對焦亡關鍵因子GSDME不表達，只發生了凋亡。如前所述，凋亡是一種“干凈”的細胞死亡，如果化療藥物僅誘發凋亡，理論上不應產生很大的毒副作用。鑒于正常組織細胞表達GSDME而癌細胞基本不表達，邵峰實驗室研究人員認為，GSDME介導的焦亡很可能是導致化療藥物產生毒副作用的原因。為了驗證這個想法，研究者制備了GSDME敲除的小鼠，與正常小鼠用多種不同化療藥物進行對比實驗，用化療藥物順鉑處理2周后的正常小鼠出現體重下降（下降幅度約為15%），腸道、脾臟和肺部組織均發生嚴重損傷和炎癥反應，而在GSDME敲除小鼠上的器官組織損傷都有明顯緩解。對于GSDME敲除的小鼠，化療藥物引起多種組織損傷和體重下降（下降幅度約為7%）都有明顯的緩解，這些結果和細胞水平的數據也吻合，淋巴細胞和T細胞、B細胞下降速度減緩，很好地驗證了研究者之前的想法。在其他幾種化療藥物如5-氟尿嘧啶（5-FU）所致小鼠腸道損傷及博萊霉素所致肺部炎癥模型上，結果也類似于順鉑處理的實驗，并進一步驗證了之前的結論。

邵峰院士表示，目前他正在思考兩個重要問題，一是細胞焦亡在T細胞活化后會殺死腫瘤細胞的機制并不明確，GSDME被caspase-3切割活化，某些情況下靶細胞被T細胞殺傷，細胞焦亡也是參與的。一旦發生焦亡，炎癥微環境就會發生變化。臨床醫師往往發現，進行化療后的癌癥患者再使用PD-1更有效，這是由于化療后不可避免有細胞焦亡發生導致炎癥微環境變化，巨噬細胞和T細胞的分化和功能都有變化。二是學術概念需要重新界定。多年來沿襲的概念是caspase-3誘導細胞凋亡，我們通過研究發現caspase-3誘導GSDME高表達也可以走細胞焦亡通路。“細胞死亡方式由底物決定，而不是由caspase決定。打個比方，caspase就像一把刀，如果用得恰當，為我們所用，殺掉入侵者可確保我們安全；如果用得不恰當，殺掉醫生就沒人看病了。”邵峰院士最后說。