ANKRD55基因單核苷酸多態性與漢族類風濕關節炎的相關性研究

陳新鵬 李 靜 尹志華 曾惠瓊 何偉珍 葉志中

深圳市福田區風濕病?？漆t院，廣東深圳 518040

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是最常見的風濕性疾病之一，病因未明，目前研究認為RA的發病是由遺傳和環境因素相互作用的結果，遺傳學因素可以解釋RA大約50%的易感性[1]。RA是一個具有復雜遺傳背景的多基因病，目前已經有很多關于RA與基因關聯度的研究報道，但是特異性基因還沒有得到驗證，分辨出每個疾病相關易感基因對闡明類RA的發病機制，發現可以用于臨床的生物標記，尋找可能的基因治療靶點，對于改變目前RA的診治水平至關重要[2]。

最近研究發現ANKRD55基因rs 6859219位點基因多態性可能是RA的重要的候選易感基因，研究發現該基因的歐美血統的RA易感性相關[3]。但目前未有針對中國人群進行進行相關研究的報道[4]，另外相關研究顯示，某些基因位點與RA自身抗體和某些細胞因子的產生、病情活動度也有一定相關性，所以本研究旨在探討漢族人群ANKRD55基因rs 6859219位點基因多態性與RA易感性的相關性，以及這一基因位點多態性與自身抗體和多種細胞因子的表達的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年3～12月在深圳市福田區風濕病?？漆t院就診的153例漢族（根據患者身份證的民族資料）RA患者，均符合1987年ACR的診斷標準。RA組153例，平均年齡52.7歲，女129例，男24例；健康對照組130例，平均年齡49.3歲，女107例，男23例，排除急性感染、糖尿病、心腦血管疾病、肝腎疾病等疾病。兩組之間性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經過醫院倫理委員會批準，并與研究對象簽訂知情同意書。

1.2 方法

乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝外周靜脈血5mL，按酚－氯仿方法提取DNA。用TaqManTM SNP Genotyping試劑采用熒光PCR方法測定樣本中的SNP，反應條件：50℃ 2min 1個循環，95℃ 10min 1個循環，95℃ 15s 40個循環，在60℃處收集熒光。反應體系為20μL體系，反應體系為20μL體 系，由 1μL的 Taqman-MGB、10μL的 Master Mix、8μL的H2O以及1μL的樣本DNA組成。用ELISA方法檢測血清中的IL-1α（interleukin 1α，白 介 素 1α）、TNF-α（tumor necrosis factor α，腫瘤壞死因子 α）、IL-4（interleukin 4，白介素4）、IL-10（interleukin 10， 白 介 素 10）、TGF-β（transforming growth factor β， 轉 化 生 長 因 子β）、抗 CCP抗 體（anti-cyclic citrullinated peptide antibody，抗環瓜氨酸肽抗體）、抗GPI抗體（Glucose 6 phosphate isomerase，葡萄糖6磷酸異構酶）；免疫比濁法檢測CRP（c reactive protein，C反應蛋白）、RF（rheumatoid factors，類風濕因子）；魏氏法檢測ESR（erythrocyte sedimentation rate，紅細胞沉降率）。

1.3 統計學處理

采用SPSS22.0軟件包對實驗數據進行數據統計分析。首先用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，檢測所收集的數據是否代表群體的基因分布。然后分析數據是否屬于正態分布，符合正態分布的計數資料以（±s）表示，變量間相關性分析采用pearson相關性分析；不符合正態分布資料，兩組間比較用非參數檢驗兩個獨立樣本的秩和檢驗（Mann-Whitney U檢驗），多組間采用χ2檢驗進行差異性比較；變量間相關性分析采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RA組和健康對照組ANKRD55 rs 6859219的SNP基因型的頻率分布

ANKRD55 rs 6859219在RA患者DNA中的表達與健康對照組相比，運Taqman-MGB探針的方法得出結果，見表1。運用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗方法得出兩組比較P＞0.05，說明樣本人群該基因頻率符合遺傳平衡法則，見表2。用SPSS.22對RA組與健康組進行卡方檢驗的差異性比較，P＞0.05，df=1，說明兩組之間的差異無統計學意義。

表1 ANKRD55 rs 6859219實驗結果統計

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗方法

2.2 RA組ANKRD55 rs 6859219 SNP基因型與自身抗體（RF、GPI、CCP）、炎癥物質（CRP、ESR）、細胞因子（IL-1α、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10、TGF-β）的相關性分析

采用SPSS.22的Spearman相關性分析，ANKRD55 rs6859219 SNP基 因 型 與 CRP、ESR、RF、GPI、CCP、IL-1α、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10、TGF-β均無相關性，P＞0.05。見表3。

3 討論

20世紀70年代研究者鑒定出了首個與RA相關的基因HLA-DRBl[5]。1987年Gregersen等[6]提出著名的“共同表位”學說，進一步揭示了遺傳因素與RA發病的重要關聯性。近年來，隨著全基因組關聯分析（GWASs）等高通量測序技術的出現，RA的遺傳病因機制研究取得了較大的成果。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指DNA序列上發生的單個核苷酸堿基之間的變異，是廣泛存在基因組中的一種變異形式，約占人類基因組中遺傳多態性的90%。目前SNP檢測技術在人類疾病的研究中得到廣泛應用，特別是在多基因復雜疾病（如腫瘤、風濕病等）遺傳易感性的探討上。至今為止，已明確與RA相關的SNP位點有 40 余個[7]，包括 HLA-DRB1、KIRs[8]、PTPN22[9]、STAT4、PADI4[10]等，為疾病的發病機制研究和風險預測提供了依據，對RA發病機制及藥物開發等研究具有重大的意義。但是，SNP的基因多態性受不同人種、不同區域等影響而不同[11]。

表3 ANKRD55 rs6859219 SNP基因型與各細胞因子之間的相關性分析

ANKRD55基因定位于染色體5q11.2，是一個錨蛋白重復序列結構域（ankyrin repeat domain，ARD）基因，編碼錨蛋白重復序列結構域蛋白質55，具體功能目前未知。錨蛋白重復序列（ankyrin repeat， ANK）是一種蛋白質序列模體，在ANK結構域（即ARD）中折疊成β2α2結構，多個ANK通過β片層或α螺旋形成一個具有親水及疏水兩種相反性質的螺旋平面。每一個ARD中ANK模體能夠與多種不同的的配體結合，介導蛋白質與蛋白質之間的相互作用，從而實現其生物功能的多樣性及復雜性[12]。目前已有報道的生物學功能包括細胞周期調節功能、轉錄活性調節的功能、腫瘤抑制作用、促進細胞的發生和分化、促進細胞黏附和細胞骨架形成等[13]。研究顯示，錨蛋白重復序列結構域蛋白質的DNA序列突變與一系列自身免疫相關性疾病相關，報道顯示與裸淋巴細胞綜合征[14]、幼年特發性關節炎[15]，2型糖尿病（還與胰島素抵抗相關）[16]、多發性硬化（MS）等疾病相關[17]。2010年Stahl EA等發表他們的針對歐洲血統的GWAS結果，結果表明ANKRD55基因 SNPrs6859219與RA具有相關性[3]。隨后Viatte S等[18]發表了仍然是針對歐洲血統的RA患者擴大樣本的研究，結果發現該SNP位點與RA具有相關性，而且進一步證實不管抗環瓜氨酸抗體是否陽性，RA患者與該基因位點都有相關性。Eyre S等[19]2013年報道了他們使用SNP陣列免疫芯片檢測分析了歐洲RA患者，結果發現該基因SNP與RA相關聯。但尚未見到針對中國人群的研究報道。

我們首次進行該基因SNP與中國漢族RA患者的關聯研究，結果顯示，在RA組與對照組的ANKRD55 rs 6859219的連鎖不平衡性和SNPs與RA的相關性分析中，所選擇的RA組樣本符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，P＞0.05。組間基因型及等位基因的比較采用SPSS.22軟件的卡方檢驗的差異性比較，自由度為1，P＞0.05，說明兩組差異無統計學意義。這與Viatte S 及Stahl等研究結果不同，未能證實ANKRD55 rs 6859219基因多態性與漢族RA患者易感性存在關聯。分析上述結果，一種可能是兩者確實沒有相關性，因為基因多態性受種族、地域等多方面的影響；二是因為所收集樣本例數不足，并不能代替所有的中國漢族人群，有必要擴大樣本進一步研究。

目前認為RA的發病機制涉及多種細胞因子，如 TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-4、IL-10、TGF-β[20]。臨床上采用生物制劑治療就是在對細胞因子研究發展起來的，而TNF-α、IL-1及IL-6拮抗劑等治療RA取得良好效果就是對細胞因子在疾病過程中充當重要角色最好的證明[21]。其中TNF-α、IL-1、IL-6在RA的發病及發展過程中起關鍵作用，是介導炎癥反應、組織損傷、免疫反應的主要介質之一。IL-4、IL-10作為抑炎因子，也參與發病調控過程。TGF-β廣泛來源于成纖維細胞、單核細胞及T細胞等，與基質維持、纖維化等過程相關。細胞因子的產生、表達水平、在體內存在持續時間等也受基因調控，如細胞因子啟動子序列多態性，啟動子多態性的不同可使細胞因子表達不同，可使用抗感染力選擇性增強，也可能引起或加重自身免疫性疾病[22-23]。但本研究結果發現細胞因子IL-1α，IL-6，TNF-α，IL-4，IL-10，TGF-β 與 ANKRD55 rs 6859219基因多態性采用Spearman相關分析結果，無明顯相關性（P＞0.05）。

RA患者還會產生多種自身抗體，如RF，早在1931年Cecil及其同事首先發現了RA患者血清的凝集作用，后續1940年Waller發現RA患者體內存在的凝集激活因子，1949年Pike將這種首先在RA患者身上發現的凝集激活因子命名為類風濕因子并沿用至今。20世紀90年代末又發現瓜氨酸是RA血清抗聚角蛋白微絲蛋白相關抗體識別的主要組成性抗原決定簇成分，因此人工合成抗環瓜氨酸多肽抗體（抗CCP抗體），相對RF，抗CCP抗體特異性明顯增高[24]。Kroot等[25]臨床觀察認為，抗CCP抗體陽性的RA患者骨破壞程度較陰性患者更嚴重，預后更差。GPI也被發現與關節炎相關，存在于RA患者，可能與局部補體沉積和炎癥反應相關。臨床上可以發現，不是每個RA患者都會出現上述所有抗體陽性，后經研究發現，抗體的產生也與基因多態性相關。如Van Gaalen等[26]研究發現抗CCP抗體與RA的HLA-II易感基因有相關性，并預示著疾病的嚴重度。而ESR、CRP作為臨床診斷及病情評估指標。RA患者的基因信息的有效性因大范圍的GWAS得到了大幅度的增長，同樣也將單核苷酸多態性（SNP，未成年人的等位基因頻率＞5%）與病情活動的RA患者的風險性聯系起來。在某些情況下，病情活動的RA患者的遺傳變異是和某些特定的原始群體聯系在一起的，而不能轉移給其他的種群，這就是疾病基因異質性的一個明確的跡象。但本組臨床資料結果分析，未發現RF、CCP、GPI、CRP、ESR與ANKRD55 rs 6859219基因多態性之間的相關性。

綜上所述，基因的單核苷酸多態性與RA的發病的相關性是目前的熱點研究，ANKRD55 rs 6859219在歐洲人群中被證實與RA的發病可能有關，但在本實驗中未證實中國漢族人群與這個基因位點多態性有關聯性，且與自身抗體、細胞因子、病情活動等也無明顯相關，除了不同人種之間的差異，樣本量少也可能是原因之一，有必要擴大樣本進一步研究。此實驗將為我們繼續探索漢族人群中與RA的發病有關的基因位點起重大參考作用，以便進一步深入研究的開展。

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