巴戟天多糖對大鼠骨髓間充質干細胞增殖和骨向分化的影響

賴滿香 馮 娟 陳 俠 徐 哲 許意平

廣東食品藥品職業學院，廣東廣州 510520

南藥巴戟天味甘、辛，性微溫；歸腎、肝經；具有補腎陽、強筋骨，祛風濕之功效；可用于治療陽痿，不孕，月經失調，少腹冷痛，風濕痹痛，筋骨痿軟等癥[1]。現代研究表明巴戟天具有強壯骨骼、調節免疫、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種藥理作用[2-6]。有文獻報道[7-9]，巴戟天多糖（morindae officinalis polysaccharide，MOP）為巴戟天抗骨質疏松的有效成分，其具有提高成骨細胞（osteoblasts，OB）的增殖和堿性磷酸酶活性。基于OB來源于骨髓間質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）， 我們考慮MOP對 BMSCs分化成OB的某些階段可能會有影響。基于此假設，本實驗觀察MOP體外對SD大鼠BMSCs增殖及骨向分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

3月齡 SD 雌性大鼠，SPF級，體重240g（由暨南大學實驗動物中心提供）；低糖DMEM培養基（佳研生物科技有限公司）；胎牛血清（奧地利PAA公司）；CCK-8（日本同仁）；ALP測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；巴戟天多糖（陜西斯諾特生物技術有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSCs 細胞的獲取 采用全骨髓貼壁法[10]，取3月齡 SD 雌性大鼠1只，脫臼處死，無菌條件下取出大鼠股骨，用PBS液反復沖洗骨髓腔，收集混合液，1500r/min，離心4min。在離心后的細胞中加入含有15%胎牛血清的低糖DMEM培養液并反復吹打，然后以1×106個/mL的密度將細胞接種到25cm2塑料培養瓶中，置于培養箱中培養，待細胞鋪滿瓶底約80%即可傳代，同時觀察細胞的生長形態變化。用流式細胞儀檢測細胞表面標記抗原CD29、CD44、CD45和CD34的表達，以鑒定是否為BMSCs。

1.2.2 MOP對BMSCs 增殖及成骨分化的影響 取生長良好的第三代BMSCs，以1×104個/mL的密度接種于96孔培養板，培養24h后添加對照組（不加藥組）、MOP（高、中、低劑量）組培養液。用CCK-8法分別檢測各組干預 1、3、5、7、9、11d BMSCs的 OD值，用PNPP法檢測經各組干預14d的 ALP 含量以確定MOP促BMSCs向OB分化的最佳劑量并用于后續實驗。后續實驗分為MOP組，空白組（未加藥的細胞組)，成骨誘導組（添加成骨誘導液的細胞組），各組干預后第7、14、21天收集細胞上清液，按ALP檢測試劑盒說明書進行ALP 含量的測定，第21天進行茜素紅染色，以評價 BMSCs 的礦化能力。

1.3 統計學分析

采用統計學軟件STATA 12.0對數據進行統計分析，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗，計數資料以百分數（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 細胞形態學觀察

剛接種的細胞多呈圓形，大小不一，胞體透亮，見圖1。24h后，可見部分細胞貼壁生長，48h 后細胞數量逐漸增多，呈圓盤狀并向外伸出突起，部分伸出偽足并呈短棒狀，可延長軸呈現漩渦狀，見圖2。細胞經流式細胞儀檢測結果顯示：CD44、CD29陽性細胞比率分別為98.25%和96.31%，CD45、CD34陽性細胞比率分別為0.69%和0.58%，說明成功獲取到BMSCs。

圖1 接種24h內的BMSCs（40×10）

圖2 接種2d的BMSCs（40×10）

2.2 MOP對 BMSCs 增殖的影響

各組細胞對BMSCs增殖均呈明顯的時效關系，從3 d起細胞增殖加速，進入對數生長期，約7～9d達到高峰，隨后進行平臺期。各組間兩兩比較，結果表明，第1天，各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。第3 ～ 11天，與對照組比較， MOP高、中濃度組OD值明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而低濃度組OD值升高不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。MOP高濃度組與MOP中、低濃度組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 MOP對BMSCs 骨向分化的影響

MOP高濃度組與對照組比較，MOP高濃度組與MOP中、低濃度組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

2.4 各組對BMSCs ALP的影響

采用 PNPP 法對誘導 7、14、21d后 BMSCs向OB 分化過程中 ALP 進行測定，見表2。第7天及第14天時，與空白組比較，MOP組和成骨誘導組的ALP活性均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），但MOP組效果不及成骨誘導組；第21天時，MOP組和成骨誘導組ALP活性均高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05），但與成骨誘導組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組BMSCs的OD值（ ± s，n=6）

表1 各組BMSCs的OD值（ ± s，n=6）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與中濃度組比較，bP ＜0.05；與低濃度組比較，cP ＜0.05

組別時間（d）11對照組 0.112±0.003 0.379±0.022 1.230±0.023 1.896±0.081 1.920±0.010 1.512±0.031高濃度組 0.138±0.002 0.589±0.016abc 1.486±0.006abc 2.071±0.054abc 2.427±0.150abc 1. 910±0.025abc中濃度組 0.129±0.062 0.560±0.301ac 1.454±0.045ac 1.918±0.001ac 2.113±0.005ac 1.802±0.001ac低濃度組 0.109±0.015 0.495±0.004 1.331±0.021 1.906±0.023 1.965±0.008 1.610±0.051 F 282.104 324.154 256.142 185.243 215.381 190.235 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 1 3 5 7 9

圖3 MOP對BMSCs ALP 活性的影響

表2 各組ALP活性測定結果（ ± s，U/100mL）

表2 各組ALP活性測定結果（ ± s，U/100mL）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，與成骨誘導組比較，△P ＜0.05

組別 時間（d）7 14 21空白組 3.0316±0.032 5.2101±0.200 5.1211±0.053 MOP組 5.121±0.022*△ 7.250±0.040*△ 6.238±0.081*成骨誘導組 6.4450±0.002* 8.6541±0.054* 7.5011±0.312*F 74.643 108.432 86.257 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表3 各組礦化結節數（ ± s，n=6）

表3 各組礦化結節數（ ± s，n=6）

注：與空白組比較，*P＜0.05，與成骨誘導組比較，△P＜0.05

組別 礦化結節數（個）對照組 4.1±0.5 MOP組 5.6±0.2*△成骨誘導組 6.1±1.2*F 15.314 P＜0.05

2.5 各組對BMSCs 礦化能力的影響

采用茜素紅染色法檢測各組干預BMSCs 21 d后的礦化結節，結果見表3。各組均可見礦化結節形成，與空白組比較， MOP組和成骨誘導組礦化結節數均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與成骨誘導組相比，MOP組礦化結節數不及成骨誘導組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

BMSCs 是從骨髓中分離的一類成體干細胞，具有很強的自我更新能力及多向分化的潛能[11]。在體外，BMSCs易于分離培養及擴增，在特定誘導條件下有很強的成骨能力，是研究骨代謝疾病應用最主要的種子細胞。體外獲取BMSCs的方法常有貼壁篩選法、密度梯度離心法、細胞表面分子標記法及免疫磁珠分選法，其中前兩種方法常用，后兩種方法雖可獲得較高純度細胞，但因細胞數量少、實驗耗時長、費用較高等原因受到限制[12]。密度梯度離心法是根據單核細胞密度不同進行梯度離心分離純化，其很容易造成BMSCs的丟失，增加了污染的機會。全骨髓貼壁法通過定期換液除去不貼壁細胞，經3～4次傳代后可獲得純度較高的BMSCs，是目前應該分離BMSCs最常用的方法[13]，故本實驗采用全骨髓貼壁法分離BMSCs。BMSCs 的鑒定目前主要借助其表面抗原性加以區分，BMSCs 在細胞貼壁附著后表達CD29[14]，CD44[15]等多種表面蛋白，但不表達造血干細胞表面標志 CD54和CD34等[16]。本實驗利用流式細胞儀檢測發現，BMSCs 表面CD29、CD44 表達量分別為98.25%和96.31%， CD45、CD34陽性細胞比率分別為0.69%和0.58%，說明本方法得到的 BMSC 純度很高，且操作簡單、穩定高效。

CCK-8法是目前檢測細胞增殖的常用方法[17]，其原理是水溶性四唑鹽-WST-8在電子載體 1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下，被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物，生成的甲臜的數量與活細胞的數量成正比[18]。在酶標儀上測定其OD 值，可間接反映活細胞數量。此法重復性好，對細胞毒性小，檢測快速，靈敏度高，誤差少，結果更加準確[19]。本實驗CCK-8結果提示，巴戟天多糖高、中濃度組從第3天開始BMSCs的增殖明顯，第9天增殖達高峰，其中高濃度組作用優于中濃度組，而巴戟天多糖低濃度組的BMSCs增殖并不明顯。說明高、中濃度的巴戟天多糖具有促BMSCs增殖的作用。

ALP是BMSCs向成骨細胞分化早期合成并分泌的成骨特異性的物質，其為水解磷酸酯沉積羥基磷灰石提供必要的磷酸，開啟礦化，促進細胞成熟，是骨形成的必需酶[20]。在BMSCs成骨分化早期，ALP表達隨著BMSCs向OB分化程度而增加，鈣化時達高峰[21]。因此，ALP通過作為衡量BMSCs向成骨細胞分化程度的重要指標，以判定骨向分化后細胞的功能狀態[22]。研究證實，經成骨誘導后的BMSCs，其最早出現ALP表達量的增加，且ALP的表達量與誘導時間成正比[23]。礦化結節的產生由于BMSCs骨向分化晚期，分泌到細胞外基質中的各種骨性蛋白與鈣、磷等分子相結合，產生羥基磷灰石結晶，逐漸形成礦化結節，它是評價藥物對骨髓間充質干細胞骨向分化功能的有效指標[24]，也是成骨細胞的另一重要特征。因此，本實驗選用ALP和礦化結節作為巴戟天多糖促BMSCs骨向分化的實驗指標，結果顯示，巴戟天多糖能夠提高 ALP 活性，增加其礦化結節數目，說明巴戟天多糖在一定程度上具有促進BMSCs分化為成骨細胞的能力。

綜上所述，巴戟天的有效成分巴戟天多糖在體外能夠促進BMSCs的增殖，提高ALP 活性及礦化結節數，說明巴戟天多糖具有促進BMSCs增殖及骨向分化的能力，但其具體可以通過何種信號途徑發揮促成骨作用，仍需要進一步研究證實。

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