五倍子聯(lián)合黃芩提取物復(fù)合液對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖和周期的影響*

譚學(xué)東 ，黎淑芳 ，朱曉瑩，黃躍斌，雷 茗

（1.廣西壯族自治區(qū)百色市右江區(qū)人民醫(yī)院，廣西 百色 533000； 2.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

2015年的流行病調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó) 80.0%～97.0%的成年人患有不同程度的牙周病[1]，臨床表現(xiàn)為牙齦發(fā)炎、出血、疼痛、口臭，嚴(yán)重者會(huì)造成牙周組織破壞，導(dǎo)致牙齒與牙齦分離[2]。常規(guī)治療以硝咪唑類（如牙康）、四環(huán)素類（如派力奧）及多西環(huán)素等藥物為主，雖能改善癥狀，但長(zhǎng)期應(yīng)用療效欠佳，且復(fù)發(fā)率較高，故研究牙周疾病的治療與防治具有較大現(xiàn)實(shí)意義[3－4]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)在牙周病的治療方面也有較好效果。五倍子又名木附子，具有抗菌、收斂、解毒等功效[5]。黃芩屬雙子葉植物，有效成分為黃酮類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗炎及抗氧化等功效[6]。本研究中采用五倍子聯(lián)合黃芩提取物復(fù)合液對(duì)牙周膜細(xì)胞(PDLC)增殖的影響進(jìn)行試驗(yàn)觀察，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合正畸臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；均經(jīng)X線、臨床表現(xiàn)等檢查確診。

排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合納入標(biāo)準(zhǔn)；合并有影響效應(yīng)指標(biāo)觀測(cè)及影響判斷其他生理或病理情況的疾病。

病例選擇：選取醫(yī)院口腔門診2015年5月至2016年7月收治的因正畸需要拔除的無(wú)齲齒、無(wú)牙周病的青少年32例，其中男19例，女13例；年齡 21～27歲，平均（24.2 ± 2.4）歲。

1.2 儀器與試藥

低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco Invitrogen Carslbad公司）；膠原酶、堿性磷酸酶試劑盒（美國(guó)Sigma St.Louis MO 公司）；四氮唑藍(lán)(MTT，德國(guó) Sigma Deisenhofen公司）；0.25% 胰蛋白酶（美國(guó) Sigma公司）。IMT－2型倒置相差顯微鏡（日本 OLYMPUS集團(tuán)）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（包括SCO5W－2 SHELDONT型培養(yǎng)箱，珠海市造鑫企業(yè)有限公司）；考馬斯亮藍(lán)試劑盒、鼠抗人波形絲蛋白（由本實(shí)驗(yàn)室提供）。五倍子 Rhus chinensis Mill.及黃芩 Scutellaria baicalensis Georgi.取自右江民族醫(yī)學(xué)院，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院黃鎖義教授鑒定為正品。

1.3 方法

1.3.1 PDLC 的培養(yǎng)與分組

取上述患者前磨牙，放入預(yù)冷的無(wú)菌Hank液中，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗3遍，刮取牙根中部1/3的牙周組織，將其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，取5 mm間隔平鋪在50 mL培養(yǎng)瓶底，加入20.0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，在37℃及5%CO2環(huán)境中連續(xù)孵育2 h，再次翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶后繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合80%時(shí)，利用2.5 g/L胰酶消化進(jìn)行傳代，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，取第5代細(xì)胞，備用。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并按加入藥物的不同分為黃芩提取液(LPS)組、五倍子組和復(fù)合液(LPS＋五倍子)組。

1.3.2 藥液制備

取一定量五倍子藥材，敲開后除去蟲垢及雜質(zhì)，沖洗清潔，干燥，粉碎，過(guò)100目篩，稱取50 g，加無(wú)離子水100 mL，室溫下浸泡24 h，過(guò)濾離心，取上清液，共2次；將上清液濃縮并冷凍干燥，所得干粉視為五倍子水提取物純品。取黃芩50 g，置乙酸乙酯中水浴3 h，將其溶解物過(guò)濾和濃縮，殘留物溶解于500 mL/L甲醇中；分離出可溶于甲醇的部分進(jìn)行濃縮，除醇，冷凍干燥，所得干粉視為黃芩提取物純品。兩組純品等比例混合，加入培養(yǎng)液，最終制備成質(zhì)量濃度為25 μg/mL的提取物變復(fù)合液。

1.3.3 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

取1.3.1項(xiàng)下生長(zhǎng)良好的第5代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/mL，接種在96孔培養(yǎng)板上，24 h培養(yǎng)后去除培養(yǎng)液及未貼壁的細(xì)胞。向黃芩提取液（LPS）組細(xì)胞液中加入100 μg/mL黃芩提取液，五倍子組細(xì)胞液中加入25 μg/mL五倍子提取液，復(fù)合液(LPS＋五倍子)組細(xì)胞液中加入 25 μg/mL 五倍子提取液、100 μg /mL黃芩提取液及100 μg/mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，分別進(jìn)行 3，6，12，24 h 孵育，向每孔中加入 20 μL MTT 溶液培養(yǎng)4 h后于倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。在酶聯(lián)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。1.3.4 細(xì)胞總蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞總蛋白含量。取第5代細(xì)胞，采用0.25%胰蛋白酶調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL 并接種在 96 孔板中，每孔 100 μL，培養(yǎng) 24 h后，吸棄原有培養(yǎng)液，每孔中加入200 μL培養(yǎng)液，分別進(jìn)行 3，6，12，24 h 孵育，每孔中加入 100 μL 0.1%TritonX溶液，震蕩30 min，觀察是否為完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)后，將其轉(zhuǎn)移至另一塊96孔板，加入200 μL考馬斯亮藍(lán)染液，振蕩10 min，在酶聯(lián)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。

1.3.5 細(xì)胞周期觀察

制備五倍子、黃芩提取物，取第5代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下進(jìn)行24 h培養(yǎng)，LPS組向細(xì)胞液中加入100 μg/mL 黃芩提取液，五倍子組中加入 25 μg/mL 五倍子提取液，復(fù)合液組中加入25 μg/mL五倍子提取液、100 μg/mL 黃芩提取液及 100 μg/mL PBS 液，連續(xù)孵育12 h。采用2.5 g/L胰酶消化細(xì)胞，收集在離心管中，離心 5 min，速率為 800～1 000 r/min，加入 4 mL PBS液，去除殘?jiān)凹?xì)胞碎片，制備單細(xì)胞懸液，加入700 mL乙醇固定，用4 mL pH為7.4的PBS溶液吹打后制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/mL，加入碘化丙啶液，染色30 min，在酶聯(lián)儀590～630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，行 χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料，以±s表示，行 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

倒置相差顯微鏡下，原代細(xì)胞形態(tài)多樣，以長(zhǎng)梭形為主，細(xì)胞突起長(zhǎng)度不一，核仁清晰，胞體豐富；第4代細(xì)胞開始分離純化，未見上皮樣細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，胞體豐滿；第5代細(xì)胞生長(zhǎng)速度良好，胞體增大，核仁清晰。詳見圖1。

2.2 細(xì)胞增殖情況、細(xì)胞總蛋白含量及細(xì)胞周期

結(jié)果見表1。

3 討論

PDLC屬牙周組織中的主要功能細(xì)胞，具有多向分化潛能，能合成膠原亦可降解膠原，在牙周膜中能不斷改進(jìn)與更新，在創(chuàng)傷修復(fù)和組織再生中發(fā)揮重要作用[7－8]。中藥取材于天然的動(dòng)植物及礦物，與西藥相比具有無(wú)污染、不良反應(yīng)小、易提取等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，五倍子聯(lián)合黃芩提取物復(fù)合液在牙周病防治中已得到應(yīng)用，且效果理想[9]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)合液組中 3，6，12，24 h細(xì)胞增殖數(shù)多于LPS組與五倍子組（P＜0.05）。

五倍子中主要含有五倍子鞣酸，經(jīng)水解后得沒(méi)食子酸與葡萄糖，藥物具有抗菌作用，能有效抑制或殺滅細(xì)菌，且有凝固蛋白的作用，能促進(jìn)小血管聚集，發(fā)揮輕微的止痛功效，且藥物中的有效成分能與堿、若干金屬等化合物結(jié)合，發(fā)揮解毒功效[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，將五倍子提取物運(yùn)用于牙周病中能有效抑制牙周致病菌，并能抑制PDLC的增殖，從而保護(hù)牙周細(xì)胞[11－12]。

圖1 人體牙周膜細(xì)胞形態(tài)（×20倍）

表1 3組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果吸光度值比較（±s）

表1 3組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果吸光度值比較（±s）

注：與 LPS組比較，aP ＜0.05；與五倍子組比較，bP ＜0.05。

組別 細(xì)胞增殖復(fù)合液組LPS組五倍子組3 h 0.354 ± 0.009ab 0.312 ± 0.005 0.313 ± 0.006 6 h 0.433 ± 0.010ab 0.326 ± 0.007 0.327 ± 0.007 12 h 0.462 ± 0.010ab 0.336 ± 0.011 0.338 ± 0.012 24 h 0.483 ± 0.013ab 0.363 ± 0.012 0.367 ± 0.013組別 細(xì)胞總蛋白含量復(fù)合液組LPS組五倍子組3 h 0.492 ± 0.009ab 0.312 ± 0.006 0.314 ± 0.006 6 h 0.518 ± 0.005ab 0.369 ± 0.006 0.370 ± 0.006 12 h 0.633 ± 0.009ab 0.435 ± 0.008 0.433 ± 0.007 24 h 0.672 ± 0.010ab 0.526 ± 0.012 0.529 ± 0.013細(xì)胞周期組別復(fù)合液組LPS組五倍子組3 h 0.504 ± 0.007ab 0.356 ± 0.004 0.354 ± 0.005 6 h 0.531 ± 0.019ab 0.432 ± 0.015 0.431 ± 0.014 12 h 0.563 ± 0.009ab 0.493 ± 0.016 0.493 ± 0.015 24 h 0.614 ± 0.010ab 0.536 ± 0.013 0.538 ± 0.015

黃芩中的有效成分為黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用，能抑制溶血性鏈球菌、葡萄球菌等生長(zhǎng)；同時(shí)，還能抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)，有效提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，還能抑制氧化反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，黃芩能有效抑制牙周可疑致病菌，提高臨床效果[13－14]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)合液組3，6，12，24 h時(shí)的細(xì)胞總蛋白含量多于LPS組與五倍子組（P＜0.05），說(shuō)明五倍子聯(lián)合黃芩提取物復(fù)合液對(duì)PDLC具有保護(hù)作用，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成；復(fù)合液組 3，6，12，24 h時(shí)的細(xì)胞周期也長(zhǎng)于LPS組與五倍子組（P＜0.05），說(shuō)明五倍子聯(lián)合黃芩提取物復(fù)合液能促進(jìn)PDLC的增殖，對(duì)牙周組織的再生具有明顯的促進(jìn)作用，在促進(jìn)牙周組織缺損、修復(fù)再生方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，五倍子聯(lián)合黃芩提取物復(fù)合液對(duì)PDLC具有保護(hù)作用，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)一步提高細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性。

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