抗菌藥物敏感性快速檢測方法研究進展

何淵慧(HE Yuan-hui)，奕巧蓮(YI Qiao-lian),杜文斌(DU Wen-bin),鄭 波(ZHENG Bo)

(1 北京大學第一醫院 臨床藥理研究所，北京 100034； 2 中國科學院微生物研究所 微生物資源前期開發國家重點實驗室，北京 100101； 3 中國科學院大學，北京 100049)

抗菌藥物的發現是二十世紀巨大的醫學成就。抗菌藥物的使用大大降低了傳染疾病的病死率，挽救了無數生命，也使以前的一些絕癥，如結核病都有了治療的方法。然而最近六十年，我們開始從抗菌藥物的輝煌時代走向抗菌藥物耐藥性時代[1]。2014年世界衛生組織發布了全球耐藥報告[2]，指出抗菌藥物耐藥細菌正蔓延至全球各地。

細菌耐藥嚴重威脅著人類健康，尤其是對于嚴重感染的患者，急需敏感度、特異度更高和更快速的檢測方法，快速確定是哪種細菌感染，并分離病原微生物進行抗菌藥物敏感試驗(antimicrobial susceptibility testing，AST)，以指導臨床選擇抗菌藥物和相應劑量。傳統檢測藥敏值的方法有肉湯稀釋法(包括微量肉湯稀釋法與宏量肉湯稀釋法)、瓊脂稀釋法、E-test法及紙片擴散法等。宏量肉湯稀釋法過程繁瑣，在不同濃度抗菌藥物溶液制備過程中易出差錯；微量肉湯稀釋法的主要缺點在標準化的商業平板中檢測的藥物種類較固定，藥物濃度梯度少，在抗菌藥物折點更新后可能無法覆蓋折點；E-test方法缺點是抗菌藥物品種有限，成本較高，且在檢測聯合藥敏時，由于系統誤差，MIC值會較高或較低[3]；此外，傳統方法檢測獲得藥敏結果常所需時間較長，易導致漏診、誤診和延誤治療[4-5]。因此，尋求新的快速、準確的病原菌耐藥檢測技術是實現臨床耐藥細菌感染快速和有效治療的核心，也是突破當前抗菌藥物濫用困境的關鍵。一些新型的藥敏檢測方法在不斷涌現。本綜述將近期基于分子生物學和適用于現場快速診斷的微型化、便攜化抗菌藥物敏感性快速檢測方法的研究進展作系統闡述。

1 自動化檢測儀器

微生物自動鑒定及藥敏測試系統結合微量快速培養基和微量生化反應系統，實現了藥敏檢測的自動化和機械化，使得原來緩慢、繁瑣的手工操作變得快速、簡單。典型的產品有法國生物梅里埃公司(BioMérieux)VITEK 2 德靈公司(MicroScan)的Walk Away SI以及BD的PHOENIX等。不同自動化儀器價格昂貴，通常依賴數據庫的更新與補足，方便有余，靈活不足。見表1。

表1 市面常見的微生物自動鑒定及藥敏測試系統

2 基于分子生物學的藥敏檢測方法

2.1 以實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative PCR, qPCR)為基礎的檢測方法 qPCR是指在PCR 反應體系中加入熒光基團(染料或探針)，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[6]。qPCR應用于AST，主要通過對擴增目的基因的定量檢測，反映不同藥物濃度下細菌的生長情況，以實現快速檢測。

目的基因的恰當選擇對檢測技術的靈敏度至關重要，并在一定程度上影響實驗結果[7]。Harris等[8]同時擴增pbp2b與lytA基因，快速診斷肺炎鏈球菌感染，發現其檢測細菌靈敏性高于同研究中以管家基因16S rRNA為目的基因的qPCR的100倍以上；pbp2b的檢測結果反映肺炎鏈球菌對青霉素的藥敏。Peuchant等[9]以沙眼衣原體功能不同的omp1、omp2、16S rRNA，以及Hsp60編碼基因groEL1 四種基因作為目的基因監測菌體的生長，最終選擇靈敏度高特異性好的omp1作為目的基因，檢測沙眼衣原體對氧氟沙星、莫西沙星、阿奇霉素、多西環素的藥敏。

在不同的耐藥性檢測中，相同細菌選擇的目的基因以管家基因16S rRNA居多[7, 10-13]，但也有選擇其他作為目的基因者，如結核分枝桿菌以特有基因rpoB作為目的基因[13]。檢測不同藥物對幽門螺桿菌的藥敏時，以23S rRNA、gyrA為目的基因[12, 14]，有研究先用管家基因16S rRNA鑒定細菌種屬， 再以23S rRNA為目的基因檢測幽門螺桿菌對克拉霉素的藥敏[12]。與檢測耐藥基因反映細菌的耐藥性不同，Kearns等以青霉素敏感基因pbp2b作為目的基因，反映肺炎鏈球菌對青霉素的AST[15]。

2.2 分子生物學法定義最低抑菌濃度(MIC)以及檢測MIC的最佳時間點 不同的研究對MIC的定義不同，檢測MIC的最佳時間也不同。處于發展階段的分子生物學檢測技術目前無統一指南，需研究者繼續探索。

Hamasuna等[16]每周一次體外試驗檢測尿道支原體，連續4周監測其生長，MIC定義為引起99%抑制率的最低藥物濃度，抑制率 (%) = [(質控組中DNA量 -測試組中DNA量)/ 質控管組中DNA量]×100%。由于第四周與第三周的MIC值相同，最終選擇第三周作為檢測MIC值的最佳時間點；Aloni-Grinstein等[17]檢測細菌1次/h，連續48 h 監測細菌在不同濃度藥物下的生長，最終選擇細菌與藥物混合培養的24 h作為MIC值檢測的最佳時間，MIC 定義為無肉眼可見的細菌，且能降低細菌濃度至低于質控菌OD630的10%時的最低藥物濃度。Peuchant等[9]在細菌與藥物共同培養后的0、3、 6、12、16、 21、25、29、 36、45和53 h分別進行檢測，由于檢測細菌的4種基因在30 h后均處于靜止狀態，因此，以30 h作為讀取MIC值的最佳時間點，MIC定義為與最初細菌DNA 濃度有相同值的最低藥物濃度。

2.3 反轉錄PCR法 用反轉錄PCR檢測細菌的耐藥性[18]，相比于以提取的DNA直接作為反應模板的熒光定量PCR法，反轉錄PCR花費時間長，檢測成本高。Peuchant等[9]用反轉錄PCR對mRNA進行定量檢測，驗證研究中目的基因是否轉錄，將MIC定義為能抑制基因轉錄的最低藥物濃度qPCR法能快速準確獲取藥敏結果，但需更多樣本進行驗證； 部分PCR或以PCR為基礎的分子生物學方法通過檢測耐藥基因反映細菌藥敏有一定的局限性，畢竟與細菌表型耐藥有關又確定的基因有限，而細菌對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、大環內酯類等抗菌藥物的耐藥又涉及成百上千的基因突變與多種耐藥機制的表達，難以通過簡單的基因檢測確定。

3 基于微流控芯片的藥敏檢測新方法

微流控芯片將生化領域中的樣品前處理、檢測等操作，經由微納米通道集成到一塊厘米級別的芯片上應用于臨床診斷，相對傳統方法更快、更靈敏。在藥敏檢測領域，利用微流控檢測細菌耐藥性主要有單細胞檢測，以及與藥敏相關的生化物質檢測。見表2。

表2 基于微流控芯片的藥敏檢測方法

3.1 基于藥敏相關的生化物質檢測藥敏 耐藥菌與敏感菌在抗菌藥物作用下會表現出不同的生化指標，利用這些指標的不同可區分耐藥菌與敏感菌。Besant等[19]利用活細胞和死細胞指示劑的氧化還原反應檢測細菌的代謝活動，并通過電化學信號讀取表征細菌的耐藥情況，減少了預培養富集的環節，1 h內即可獲得耐藥表型結果。Mach等[20]將泌尿道感染采集的尿樣品直接與含抗菌藥物培養基培養2.5 h后，利用電化學定量檢測細菌16S rRNA水平可得到細菌耐藥表型，從收集尿樣本到獲得檢測結果僅需3.5 h。Burckhardt等[21]直接利用MALDI-TOF鑒定菌種并檢測NDM-1、VIM-1、VIM-2、KPC-2和不同種類的IMP酶獲得細菌對碳青霉烯類藥物的耐藥情況，較之傳統的利用光密度檢測方法，質譜檢測更精準并快捷，在1～2.5 h內即可獲得檢測結果。MALTI-TOF還不能檢測所有與耐藥相關的蛋白，以上這些方法依賴復雜的儀器，芯片的制作復雜，不利于推廣。

3.2 微流控 pH 感應器檢測法 監測代謝產物可應用于細菌的功能測定[22-23]。在細菌培養過程中，生長培養基由于葡萄糖或糖代謝產物有機酸的積累變得酸化，監測培養基pH值的變化已成為細菌功能分析常用方法之一。抗菌藥物可抑制細菌的生長，降低葡萄糖代謝率。檢測固定在納升孔道中快速積累的細菌代謝產物，避免了耗時的預孵育，從而減少檢測時間。有效光學厚度[24]作為光學信號，可反映由pH值變化引起的殼聚糖水凝膠的溶脹，通過監測EOT增加率，確定抗菌藥物對細菌的抑制作用。

實驗中，每20 min檢測了一次，監測時長約3 h。依據抑制率定義抗菌活性，抑制率的公式：I =(△EOTblank-△EOTantibiotic)/△EOTblank；公式中△EOTblank和△EOTantibiotic分別代表在該時期無抗菌藥物樣本和有抗菌藥物樣本EOT的變化。

基于抑制率的MIC檢測方法尚未確定，不同時期檢測的MIC值大不相同，檢測MIC值的最佳時間仍在探索中，但最多需要2 h。反應中菌液最初濃度與微量肉湯稀釋法的最初濃度5×105CFU/mL一致，而藥物的濃度范圍為包括由美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)指南推薦的用于臨床分離菌中檢測MIC抗菌藥物濃度內的連續5個2倍稀釋梯度濃度[25]。

微流控pH感應器檢測法獲得AST檢測結果所需時間短，能在細菌的代謝水平上檢測細菌的藥敏值，培養時間不同，MIC值明顯不同，對MIC值檢測的最佳時間的確定將是該研究的另一探索。

3.3 微流控檢測細胞膜機械壓力 機械壓力和酶的聯合作用破壞細菌的生物膜，藥物能干擾敏感菌修復生物膜系統，卻不能干擾耐藥菌，熒光標記的生物膜以呈現的顏色不同被分為活細菌與死細菌，利用該裝置收集的不同熒光信號，以細菌死亡的速度確定細菌的表型(易感與抗性)，反映細菌的藥敏，分別用甲氧西林耐藥、敏感的質控菌作為模型，建立檢測體系后，用16株臨床分離金黃色葡萄球菌進行驗證。

研究中每2 min檢測一次，連續監測60 min，該監測提供了定量信息，不需MIC檢測，即可提供一個客觀的藥敏評價標準。由于藥液菌液混合培養60 min為細菌死亡率最高的時期，該研究以此作為AST檢測的最佳時間點。經驗性的以模型細菌死亡率的0.5%、1%分別作為敏感與中介、中介與耐藥的分界點，以此建立敏感、中介、耐藥的檢測標準，對細菌的耐藥敏感與否進行定性分析。同時對苯唑西林10、50 mg/L檢測濃度進行摸索，由于50 mg/L的檢測結果更接近以紙片擴散法作為對照方法的檢測結果，被選擇作為細菌耐藥性的檢測濃度[26]。該方法從表型分析細菌耐藥性，快速獲得AST檢測結果。研究著重于機械力和酶的破壞力[27-28]，經驗性建立的耐藥、中介、敏感的分界標準，也需進一步驗證，且不能檢測細菌對抑菌劑的藥敏狀況。

3.4 單細胞檢測藥敏 單細胞檢測可有效避免傳統方法中生長富集的過程。Liu等[29]將待檢菌與含有抗菌藥物的培養基一起包裹在皮升級液滴中共培養，利用耐藥菌增殖改變光學性質，從而篩選出耐藥菌得到藥敏結果，但該方法存在的問題是每次只能進行一種條件的篩選。Choi等[30]在顯微鏡下追蹤單細菌在抗菌藥物作用下發生的形態變化，通過研究細菌的分裂行為，得到細菌的耐藥表型，高分辨顯微識別分析圖像需要相應的儀器支持，限制了其檢測通量。Baltekin等采用微流控芯片捕獲臨床分離樣本中的細菌，用顯微鏡觀察多個單細菌在不同濃度下的生物反應狀況，30 min即可獲得細菌對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、美西林、多利培南、環丙沙星、左氧氟沙星、磷霉素、呋喃妥因、磺胺等臨床治療泌尿系感染常用的9種藥物的藥敏結果[31]，但該研究檢測對象只有大腸埃希菌，并未涉及腸球菌屬細菌等其他種類細菌。Longo等[32]提出了一種基于原子力顯微鏡的檢測方法，在該方法中，懸臂可以在細菌低濃度的情況下表征細菌的代謝活動，通過檢測細胞膜的變化，在十分鐘內讀取細菌對抗菌藥物的敏感性，該方法只能得到粗略的耐藥結果，且所需儀器操作要求高，不利于推廣。

基于單細胞的藥敏檢測雖然縮短了單次檢測時間，但增加了檢測總量，實際并沒有提高檢測效率。

4 其他快速藥敏檢測方法

4.1 Micromax 試劑盒 原理：研究者利用Micromax 試劑盒，檢測細菌在含不同濃度藥物的培養基中生長時DNA的狀況，判斷細菌對藥物的敏感、中介及耐藥情況。依據美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)指南，Bou等[33]選擇細菌敏感、中介、耐藥等4個藥物折點濃度，將試驗菌株分別與不同濃度的藥物在培養基中共同培養60 min，并對試驗細菌的DNA進行染色。細菌在CLSI定義為敏感濃度的藥物中孵育60 min，DNA出現擴散的現象，則該細菌對該藥物敏感；細菌在CLSI定義為中介濃度的藥物中孵育60 min，DNA才出現擴散的現象，則該細菌對該藥物為中介；細菌在CLSI定義為耐藥濃度的藥物中保持完整或者在比耐藥濃度更高濃度的藥物中孵育60 min后DNA才出現擴散的現象，則該細菌對該藥物耐藥。

Bou等先用該方法分別檢測標準菌株對美羅培南、環丙沙星的藥敏情況，再用322株臨床分離菌株進一步驗證，以微量肉湯稀釋法和E-test法的檢測結果作為對照，新方法60 min即可獲得與對照方法完全一致的檢測結果。雖然在檢測過程中，檢測背景里會出現多余的DNA片段，但由于檢測背景可變，這些片段的量較少，而且只是在與抗菌藥物共同孵育前的培養基中出現，并不會影響檢測結果的判斷[33]。

該方法準確快速獲取定性藥敏檢測結果，未涉及細菌對抑菌劑的藥敏檢測，但還需要更多種類的抗菌藥物和更多種類的細菌進一步驗證。

4.2 SERS-AST 法 該技術監測細菌的活性，賦予其光譜特異性。當細菌與不同濃度藥物混合后，由細菌表面特異性標志物減少引起的拉曼散射(surface-enhanced Raman spectroscopic，SERS)光譜強度2 h內下降，依據下降的比例反映細菌的AST結果。

研究者分別在細菌與藥物混合后培養的0、1、2、4、6 h進行檢測，并監測細菌的生長，取2 h作為檢測MIC值的最佳檢測時間，革蘭陽性菌：r730 < 0.5；革蘭陰性菌：r654<0.5 或 r724<0.5(r730/r654/r724為分別在730/cm、654/cm、724/cm處拉曼散射峰的信號率)，作為判斷抗菌藥物發揮活性的標準。MIC值檢測時間點定為混合培養后2 h，這是綜合藥物治療效果之后的經驗性選擇。藥物濃度設置為包含標準濃度在內的由低至高的4個濃度，并探索性的設置最初檢測細菌濃度為1×106、1×107、1×108CFU/mL三個等次，最終選擇與微量肉湯稀釋法藥敏結果最接近的1×106CFU/mL作為檢測細菌的最初濃度[29]。

SERS-AST 法所得AST檢測結果與微量肉湯稀釋法結果基本一致，傳統方法需過夜培養，而該方法只需菌液與藥物共同培養2 h。研究者經驗性的選擇革蘭陽性菌r730 < 0.5，革蘭陰性菌r654 < 0.5 或者 r724 < 0.5作為有抗菌活性的評判標準，仍需進一步驗證；值得一提的是該儀器的最低檢測限度為1×105CFU/mL，在一定程度上限制了MIC值的檢測；SERS-AST 法檢測成本亦不容忽視；另外，其只檢測了細菌對苯唑西林與亞胺培南的藥敏，對于抑菌劑等其他種類的藥物需要更多驗證。

5 總結

多種檢測技術的興起為臨床提供快速的AST檢測結果，qPCR法3 h即可獲得結果[17]，敏感度高，污染低，操作容易且結果準確[34]，其他方法檢測時間更短[26,29,33]，能夠獲得傳統藥敏檢測方法難以得到的藥敏值，特別適用于傳統培養皿中不能生長或生長緩慢的病原微生物[16]，為治療效果提供重要信息[8]，使患者從昂貴的廣譜抗菌藥物轉向更精準實惠的藥物治療，有利于減少耐藥細菌的產生。

mRNA 水平的基因表達分析結果僅能提示蛋白水平或功能學的改變，而非確證[35]。目前，僅有限的證據說明突變類型和抗菌藥物耐藥性水平有關，但不可能十分準確地從分子水平預測其耐藥水平[36]。而SERS-AST 法通過監測細菌表面特異性標志物的光譜強度在不同藥物濃度中下降的比例，反映細菌的AST結果；微流控pH感應器檢測法通過監測細菌在不同濃度藥物中代謝產物引起培養基pH值的變化，獲得AST結果；微流控平臺檢測法利用耐藥或者敏感細菌能否在藥物干擾下修復生物膜系統，反映細菌的耐藥與否。

依據細菌譜進行傳統法培養對監測細菌生長意義重大，研究者在實驗設計中應根據自己的研究目的選擇最適宜的檢測方法[7]。Lehours等[37]建議,實驗者在標準微生物培養失敗后，方考慮分子生物學方法。

慶大霉素處于高濃度方有抑菌作用[38]，藥物處理至少32 h后才有對抗胞內生長菌作用[17]，處理5 d 后才完全發揮作用[39]。由此看來，檢測慢性細胞膜滲透藥物對微生物的藥敏時，分子生物學檢測技術尚待考慮。

上述研究均有不足，大多強調需要更大樣本量的驗證，并未提及檢測成本[29, 40-41]。AST檢測新技術仍在發展中，并未取代傳統方法[29]，檢測成本是qPCR檢測技術廣泛應用于臨床細菌AST檢測的主要障礙[16]。

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