不同來源革蘭陰性菌armA基因分布與氨基糖苷類抗生素耐藥性

龔 林, 李 娟, 袁 敏, 陳 霞, 盧金星, 梁建生, 羅成旺

(1 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 102206；2 武漢市疾病預防控制中心，湖北 武漢 430015)

近年來，越來越多的菌株產生了對氨基糖苷類抗生素的耐藥性，使臨床上常用的氨基糖苷類抗生素的臨床抗感染效果日益減弱。 16S rRNA甲基化酶的產生是氨基糖苷類抗生素耐藥的重要機制，該類酶的產生阻斷了氨基糖苷類藥物與作用靶點的接合，介導細菌對幾乎所有的氨基糖苷類藥物高水平耐藥[1]。

編碼該酶的基因包括npmA、armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG和rmtH[2]，其中armA基因是分布最廣泛的16S rRNA甲基化酶基因[3]。它于2003年在法國一株肺炎克雷伯菌中被發現[4]，隨后的幾年里，西班牙、日本、保加利亞、韓國、臺灣地區等均有報道[5-10]。且該基因也發現于多種革蘭陰性菌中，包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、黏質沙雷菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌等[6-10]，在世界各地呈現出散發或暴發的趨勢。armA基因由774個堿基組成，其G+C含量為30.4%，比其他16s rRNA甲基化酶基因都低，并且armA基因編碼的氨基酸與其他16s rRNA甲基化酶氨基酸的同源性均低于30%[11]。該編碼基因通常位于質粒、轉座子或I 類整合子[11]上，通過其高度可移動性，可在菌株間廣泛轉移和傳播。目前，耐氨基糖苷類抗生素的armA基因在不同地區的革蘭陰性菌中分布相差懸殊[12-15]。因此，有必要對其進行流行病學調查，以闡明armA在氨基糖苷類抗生素耐藥中的作用和地位。本研究對不同來源的革蘭陰性菌進行了氨基糖苷類耐藥性分析和armA基因檢測，以了解該基因在本地區的流行特征以及基因型與藥敏表型的關系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2011年2月—2014年11月不同來源的革蘭陰性菌953株，其中846株菌株分離自國內3所三甲醫院住院患者送檢的痰、分泌物、尿、血、腦脊液等非重復標本；107株菌株來自于山東某養雞場和屠宰場的種雞體表、種雞內臟、養殖人員體表、屠宰人員體表、屠宰水、屠宰雞等標本。

1.2 儀器和試劑 熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)、VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(法國生物梅里埃公司)、熒光定量PCR反應試劑(瑞士Roche公司)、細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 菌株鑒定及藥敏試驗 所有菌株鑒定及藥敏試驗采用VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，按美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2016年版標準判讀藥敏試驗結果。

1.4armA基因的檢測 采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取革蘭陰性菌基因組。熒光定量PCR的方法檢測armA基因，引物及探針如下：armA-F:5’-TCAAAAACCTATACTTTATCGTCGTCTT-3’，armA-R:5’-TATTTTAGATTTTGGTTGTGGCTTCA-3’，TaqMan探針：FAM-AACTTCCCAATAATGCTAC-MGB，擴增片段長度為162bp[16]。擴增反應體系參考相關文獻[16]。LightCycler○R480熒光定量PCR擴增程序如下：(1)預變性：95℃ 3 min；(2) 擴增: 95℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 1 s，40個循環；(3)冷卻：40℃ 10 s。

2 結果

2.1 基本情況 本研究共收集953株革蘭陰性菌，其中846株為臨床來源菌株，107株為養殖場來源菌株。臨床來源菌株種屬分布為：克雷伯菌屬385株，不動桿菌屬176株，埃希菌屬91株，假單胞菌屬66株，腸桿菌屬48株，沙雷菌屬27株，其他種屬53株；養殖場來源均為克雷伯菌屬菌株。

2.2 對氨基糖苷類藥敏結果 除沙雷菌屬和不動桿菌屬外，其他菌屬對阿米卡星藥物敏感性的MIC50均≤8 μg /mL；不動桿菌屬的耐藥率最高，為86.4%，埃希菌屬的耐藥率最低，僅為7.7%。菌株對慶大霉素藥物敏感性的MIC50均≥16 μg/mL；各菌屬對慶大霉素耐藥率均在54%以上，其中耐藥率最高的為不動桿菌屬，達89.8%。見表1。

2.3armA基因攜帶情況 本研究收集的菌株armA陽性率為26.9%(256/953)，其中armA陽性率最高的是不動桿菌屬，高達66.5%；埃希菌屬和假單胞菌屬armA陽性率較低，僅為3.3%和3.0%。見表1。

表1 不同種屬菌株對氨基糖苷類抗生素耐藥情況及armA基因檢測結果

2.4armA基因攜帶與藥物敏感性的關系 256株armA陽性菌株對阿米卡星和慶大霉素耐藥率高達95.7%和98.4%，極少數armA陽性菌株對阿米卡星和慶大霉素敏感，比率分別為4.3%和1.6%； 697株armA陰性菌株中仍有部分菌株對阿米卡星和慶大霉素耐藥，比率分別為14.6%和49.6%，見表2。對兩表中基因與藥物作關聯性分析，阿米卡星、慶大霉素關聯系數(r)分別為0.598、0.408，均P<0.001，攜帶armA基因的菌株與兩種氨基糖苷類抗生素的藥敏表型均存在關聯，且與阿米卡星藥敏表型的關聯性更強。

2.5 對不同氨基糖苷類藥物耐藥率的比較 攜帶armA基因的革蘭陰性菌對慶大霉素與阿米卡星耐藥率的差異無統計學意義(均P>0.05)；未攜帶armA基因的革蘭陰性菌中，臨床來源的腸桿菌屬、埃希菌屬、克雷伯菌屬、假單胞菌屬和不動桿菌屬對慶大霉素的耐藥率均高于阿米卡星，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表2953株革蘭陰性菌armA基因攜帶及其對阿米卡星、慶大霉素的耐藥情況(株)

Table2Carrying ofarmA gene, as well as amikacin and gentamicin resistance of 953 gram-negative bacterial strains (No. of isolates)

armA攜帶株數阿米卡星耐藥非耐藥慶大霉素耐藥非耐藥陽性256245112524陰性697102595346351合計953347606598355

表3 不同菌屬armA基因攜帶及其對氨基糖苷類耐藥情況(株)

*：Fisher’s確切概率法

2.6 不同來源克雷伯菌屬armA基因攜帶與耐藥性的比較 養殖場來源克雷伯菌屬對阿米卡星、慶大霉素耐藥率和armA基因攜帶率分別為74.8%、79.4%和65.4%，均高于臨床來源菌株(χ2值分別為166.59、32.79、158.26，均P<0.05)。見表4。

表4不同來源克雷伯菌屬對氨基糖苷類抗生素耐藥及armA基因檢出情況[株(%)]

Table4Aminoglycoside resistance and detection results ofarmA gene inKlebsiellaspp. strains from different sources (No. of isolates[%])

來源菌株數阿米卡星耐藥慶大霉素耐藥armA基因陽性臨床來源38549(12．7)186(48．3)35(9．1)養殖場來源10780(74．8)85(79．4)70(65．4)

3 討論

氨基糖苷類抗生素是臨床抗感染治療的重要藥物。了解細菌對氨基糖苷類抗生素耐藥現狀及其耐藥性發展趨勢，將為控制耐藥菌的傳播提供重要信息[17]。由于armA基因在國內外各地區的革蘭陰性菌中分布相差懸殊，本研究較大規模的調查了國內部分地區的臨床來源和養殖場來源的革蘭陰性菌對氨基糖苷類抗生素的藥物敏感性和armA的攜帶情況，為了解該地區細菌中armA的分布提供線索，明確該地區armA在氨基糖苷類抗生素耐藥中的作用。但本試驗仍存在部分局限性：菌株來源非隨機樣本，不能完全反映研究地區的氨基糖苷類耐藥和基因攜帶水平。

本研究收集的953株革蘭陰性菌對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別為36.4%和62.7%，與吳瓊等[18]報道的基本一致。其中不動桿菌屬對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率已分別達到86.4%和89.8%，提示氨基糖苷類抗生素已很難有效地治療由不動桿菌屬引起的感染。其次克雷伯菌屬、腸桿菌屬和沙雷菌屬對氨基糖苷類抗生素的耐藥性也日益嚴重。如果耐藥菌的產生和傳播不能得到有效控制，將進一步削弱氨基糖苷類抗生素的臨床使用價值。

本研究菌株中armA基因陽性率為26.9%。潘韻峰等[19]在國內多個省市各醫院調查發現，鮑曼不動桿菌中armA基因陽性率達47.7%，本研究的調查結果為66.5%，提示該基因在鮑曼不動桿菌中存在進一步擴散的可能。此外，armA陽性率在沙雷菌屬、腸桿菌屬中也高達51.9%和27.1%，提示armA 基因的傳播可能已突破菌屬界限，實現了種屬間的水平傳播。

本次研究分析了攜帶armA基因菌株的藥物敏感性，其對阿米卡星和慶大霉素耐藥率高達95.7%和98.4%。由此可見，armA基因的攜帶與氨基糖苷類抗生素耐藥表型具有很高的一致性，此結果也與armA的耐藥機制相吻合：修飾氨基糖苷類抗生素的作用靶點，從而導致細菌幾乎對所有氨基糖苷類抗生素高水平耐藥。本研究中發現部分菌株雖然耐藥，但未檢出armA基因，提示還存在其他氨基糖苷類耐藥機制。也有極少數菌株雖然基因檢測陽性，但表現為敏感，armA基因是否發生了突變或者是否其轉錄、表達受到了抑制尚待進一步驗證[20]。養殖場來源克雷伯菌屬菌株的armA基因攜帶率高于臨床來源，提示armA基因在養殖場來源菌株中的流行度可能更廣。相關部門應加強動物養殖中對抗菌藥物使用的監管，密切監測動物源菌的耐藥情況以及流行趨勢，采用各種防治手段進行控制，以減少耐藥菌的傳播[20]。

[參考文獻]

[1] Yokoyama K, Doi Y, Y amane K, et al. Acquisition of 16S rRNA methylase gene inPseudomonasaeruginosa[J]. Lancet, 2003, 362(9399):1888-1893.

[2] 王珊，呂媛，李耘，等. 我國阿米卡星耐藥大腸埃希菌16S rRNA甲基化酶基因及其水平轉移研究[J]. 中國臨床藥理學雜志,2015,31(4):283-285.

[3] 潘韻峰, 周華, 俞云松. 導致高水平氨基糖苷類抗生素耐藥的新型16S rRNA 甲基化酶基因研究進展[J]. 中華檢驗醫學雜志, 2007,30(6):699-701.

[4] Galimand M, Courvalin P, Lambert T.Plasmid-mediated high level resistance to aminoglycosides in Enterobacteriaceae due to 16S rRNA methylation[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(8)： 2565-2671.

[5] Yamane K, Wachino J, Doi Y, et al. Global spread of multiple aminoglycoside resistance gene[J]. Emerg Infect Dis, 2005, 11(6): 951-953.

[6] Doi Y，Yokoyama K，Yamane K，et al. Plasmid mediated 16S rRNA methylase inSerratiamarcescensconferring high level resistance to aminoglycosides[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(2): 491-496.

[7] Waehino J, Yamane K, Shibayama K, et al.Novel plasmid-mediated 16S rRNA methylase, RmtC， found in aProteusmira-bilisisolate demonstrating extraordinary high level resistance against various aminoglycosides[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(1): 178-184.

[8] Doi Y, de Oliveira Garcia D, Adams J, et al. Coproduction of novel 16S rRNA methylase RmtD and metalio-lactamase SPM-1 in a panresistantPseudomonasaeruginosaisolate from Brazil[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(3): 852-856.

[9] Van JJ，Wu JJ, Ko WC，et al. Plasmid-mediated 16S rRNA methylases conferring high-level aminoglycoside resistance inEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniaeisolates from two Taiwanese hospitals[J]. J Anitimicrob Chemother, 2004, 54(6): 1007-1012.

[10] González-Zorn B, Teshager T, Casas M, et al.armA and aminoglycoside resistance inEscherichiacoli[J]. Emerg Infect Dis, 2005, 11(6): 954-956.

[11] 韓玲. 革蘭陰性菌中16S rRNA甲基化酶基因的檢測[D].大連：大連醫科大學，2010.

[12] 倪舒芳,錢雅芬,孫婷婷,等.鮑曼不動桿菌臨床分離株16S rRNA甲基化酶基因研究[J].中國抗生素雜志,2011,36(12):935-938.

[13] Shrestha S, Tada T, Shrestha B, et al. Emergence of amino-glycoside resistance due toarmA methylase in multi-drug resistantAcinetobacterbaumanniiisolates in a university hospital in Nepal[J]. J Nepal Health Res Counc, 2016, 14(33): 72-76.

[14] 黃和贊,羅來恒,萬鳴春,等.鮑曼不動桿菌耐藥性及armA甲基化酶檢測與分析[J].中國抗生素雜志,2014,39(3):234-235.

[15] Piekarska K, Zacharczuk K, Wolkowicz T, et al. Distribution of 16S rRNA methylases among different species of aminoglycoside-resistant Enterobacteriaceae in a tertiary care hospital in Poland[J]. Adv Clin Exp Med, 2016, 25(3): 539-544.

[16] 龔林,袁敏,陳霞，等.氨基糖苷類藥物耐藥基因armA熒光定量PCR檢測方法的建立[J].疾病監測,2014,29(11):901-904.

[17] 代敏. PCR和核酸探針檢測豬源沙門氏菌四環素耐藥基因tetC的研究[J].畜牧獸醫學報, 2005 , 36 (5) :482-485.

[18] 吳瓊,韓立中,孫景勇,等. 氨基糖苷類耐藥的腸桿菌科細菌16S rRNA甲基化酶基因研究[J],檢驗醫學,2014,29(5):528-534.

[19] 潘韻峰,周華,俞云松.16S rRNA甲基化酶基因在鮑曼不動桿菌中的分布[J].中華傳染病雜志,2007,25(10):593-596.

[20] 龔林.氨基糖苷類耐藥基因armA實時熒光PCR檢測方法的建立、應用及NDM-5陽性大腸埃希菌的特征研究[D].北京：中國疾病預防控制中心,2015.