大鼠腰椎終板軟骨干細胞的分離與鑒定

王 效,肖 良,徐宏光,金中行

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 脊柱外科，安徽 蕪湖 241001)

椎間盤由上下邊界椎體終板、中間由外到內依次是纖維環和髓核組成，其退變是由負荷、年齡、外傷等多種因素介導的慢性過程，可以引起椎間隙狹窄、運動階段失穩、小關節退變，進而引起神經卡壓和刺激，進一步導致臨床上的腰腿痛和下腰痛癥狀。臨床上內科治療多以理療為主，外科手術雖然能解決終末期癥狀，但是無法改變脊柱在壓力負荷下的退變進程。本文利用干細胞自身生長特點，采用單克隆法培養出細胞集落，通過成骨、成脂肪及成軟骨的三向誘導，證明了該集落具有干細胞性質，為椎間盤退變的治療提供了新思路。運用干細胞治療椎間盤退變不僅能維持脊柱正常的受力形態，而且能大幅度減少手術造成的創傷，具有巨大的潛力和社會經濟效益。

1 材料與方法

1.1 主要材料 0.05%透明質酸酶，0.25%EDTA-胰酶(Gibco)，0.2%二型膠原酶(Sigma),DMEM/F12(Gebico),干細胞血清(雙洳)，地塞米松，胰島素，吲哚美辛，β-磷酸甘油,L-抗壞血酸-2-磷酸酯,甲基異丁基黃嘌呤(IBMX),脯氨酸,丙酮酸鈉,胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸混合物,腫瘤生長因子-b3。油紅O染色劑，茜素紅染色劑，甲苯胺藍染色劑，10 cm培養皿。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腰椎終板軟骨原代細胞的獲取 取4周齡大鼠幼鼠1只，給予頸椎脫臼法處死后，全部浸沒于75%的酒精10 min，無菌條件下分離大鼠幼鼠腰椎L1～L5，解剖顯微鏡下分離終板軟骨(圖1)，然后將分離到的軟骨浸泡在含有雙抗的PBS中10 min，取出后PBS沖洗3次，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小。……