骨關節炎患者血清中DKK-1和MMP-13水平的相關研究*

劉 煥，孫 磊，劉 華，崔國峰，陳慶平，王素芝，馬曉紅

1.西安市第五醫院風濕免疫科(西安710082)，2.西安交通大學第二附屬醫院骨科(西安710004)， 3.西安市中醫醫院皮膚科(西安710021)

骨關節炎(Osteoarthritis,OA)是一種引起關節軟骨的損害，骨贅形成，軟骨下硬化，以及滑膜炎的常見老年退行性疾病。近年OA的發病率逐年升高，嚴重降低人類的生活質量，威脅著人類健康。最新研究顯示: Wnt途徑在骨與關節形成和破壞中起關鍵的調控作用。多項研究表明: Wnt信號異常與OA發病有關[1]。這個途徑被幾個不同的抑制性的分泌型分子調控，如抑癌蛋白DKK1抗原(DKK-1)，硬化素，卷曲蛋白等，其中DKK-1很重要，DKK-1 可以抑制這條路徑[2]。研究顯示：DKK-1在OA的膝關節的滑膜、軟骨及軟骨下的成骨細胞中均有表達，在炎癥性及退行性關節病中，DKK-1對關節重構起調控作用[3]。

MMPs是Wnt/β-catenin信號路徑中現有調節因子之一[4]。MMP-13是一種膠原酶，由軟骨細胞、滑膜細胞、纖維母細胞及中性粒細胞等產生。主要功能是分解細胞外基質，參與了人體多種生理和病理過程。該因子在MMP-13是水解Ⅱ型膠原的重要MMP之一，其可加速細胞外基質降解，促進軟骨退變。

以往研究顯示：激活Wnt信號誘導MMPs的產生可以導致OA。那么DKK-1作為Wnt路徑的抑制者是否可以通過抑制MMP-13的表達而影響OA的發生。因此，本實驗選擇了DKK-1和MMPs中的MMP-13水平，觀察兩指標相關性。

資料與方法

1 一般資料 選擇68例門診及住院的OA患者， 2016年1月至2017年7月來西安市第五醫院風濕科就診的患者，其中男42例，女26例，年齡45～74歲，平均(61.47±6.86)歲。均為另外選取同期來我院體檢中心年齡匹配的72例作為正常對照組，其中男35例，女37例，年齡45～76歲，平均(62.31±7.43)歲，所有入選人員均簽署知情同意書。OA患者符合《骨關節炎診斷及治療指南》所推薦的診斷標準，并排除類風濕關節炎或其他骨關節系統疾病病史，并排除近期曾接受過免疫及藥物治療的患者。研究方案通西安市第五醫院醫院倫理委員會同意。

2 研究方法

2.1 實驗標本處理：取受試者肘正中靜脈血1.5ml，3000r/min離心10min，分離上層血清，置-80℃保存用于測定血清DKK-1、MMP-13的表達。

2.2 試劑及方法：采用武漢博士德生物工程有限公司購置的試劑盒測定血清DKK-1及MMP-13水平，操作均按說明書。

結 果

1 兩組血清中DKK-1及MMP-13的表達比較 見表1～3。與對照組相比，OA組血清DKK-1水平降低，MMP-13水平明顯高，差異均有統計學意義(P<0.01)。分別單獨分析檢查男性或女性時，與正常組相比，OA組患者的DKK-1血清水平減低，但MMP-13血清水平升高。

2 OA患者血清DKK-1與MMP-13相關性分析 見圖1。分析測定所有受試者血清中DKK-1與MMP-13水平的相關性。可見DKK-1水平與MMP-13呈顯著負相關(r=-0.588，P<0.01)。

表1 兩組血清中DKK-1及MMP-13的表達比較(ng/L)

注：與正常組比較，*P<0.01

表2 男性血清DKK-1及MMP-13表達水平(ng/L)

注：與正常組比較，*P<0.05

表3 女性血清DKK-1及MMP-13表達水平(ng/L)

注：與正常組比較，*P<0.05

圖1 OA患者血清DKK-1與MMP-13相關性分析

討 論

以往認為骨關節炎(OA)是一種退行性關節病變，與增齡和運動過量相關，但現在研究發現：越來越多的研究提示OA也存在嚴重的多種免疫炎癥反應。研究發現：OA組軟骨細胞IL-1β、TNF-α明顯增高，通過透明質酸的關節腔注射，并隨著透明質酸劑量增高可抑制IL-1β、TNF-α合成,起到抑制TNF-α的作用，從而達到減輕炎癥反應，改善臨床癥狀的作用[5]。另一項研究同樣表明：OA與免疫炎癥反應相關，李娟等通過研究發現玻璃酸鈉關節腔注射治療無效的KOA患者,甲氨蝶呤關節腔注射治療可有效減輕膝骨關節炎疼痛,改善關節功能。甲氨蝶呤為一種強有力的免疫抑制劑，通過甲氨蝶呤對關節炎炎癥反應的抑制，有效的控制了關節骨水腫的發生，改善了OA的病情發展[6]。另外，影像學檢查的發展，應用MRI進行分析對OA具有重要作用，王功夏等選取膝關節骨關節炎患者60例,行磁共振(MRI)掃描及KOA MOAKS評分,同時對患者進行WOMAC OA調查,分析半定量膝關節骨關節炎MRI評分系統與WOMAC OA指數的相關性。結果:MRI顯示軟骨損傷58例,骨髓損傷53例,骨贅58例,半月板形態及信號異常57例,半月板位置異常35例,Hoffa滑膜炎45例,檢出率分別為96.67%、88.33%、96.67%、95.00%、58.00%、75.00%，提示:KOA MOAKS能較好的反應出患者關節損傷程度,與OMAC OA指數有較好的相關性,可作為膝關節OA病情評估的重要指標[7]。同時，外科的手術治療，可能對炎癥具有消除作用，同時改善力學結構，從而改善OA的病情，馬曉軍等研究提示：全膝關節置換術應用于晚期膝關節OA老年患者的治療可以起到很好的效果。可以有效緩解患者的疼痛癥狀,更快地恢復膝關節功能,值得臨床應用[8]。

隨著對OA發病機制的不斷認識和理論更新，研究Wnt信號途徑，并在骨形成及破壞中有重要的作用成為研究熱點。另一方面，多種骨關節疾病的骨代謝紊亂過程，是Wnt信號途徑發揮了重要的生物學作用。DKK-1主要是由細胞內分泌而來的分泌型糖蛋白，是一種內源性蛋白質或者是生物活性物質，其作為Wnt信號途徑的抑制劑，可以阻止信號在細胞內進行傳遞，從而參與細胞的增殖、分化及遷徙等過程[9]。近年來，隨著逐漸深入了解Wnt信號通路與骨形成關系之間的關系，進一步探索骨關節疾病中DKK-1的作用已成為新的研究熱點。

MMPs是Wnt/β-catenin信號通路中的下游靶基因之一。Le Maitre發現：外科標本中退行性椎間盤組織的MMP-13表達顯著增加，與退化嚴重程度正相關。研究結果表明：DKK-1通過特異性阻斷Wnt通道抑制MMP-13的表達，保護了Ⅱ型膠原和蛋白多糖的基質合成[10]。OA疾病研究中發現DKK-1依賴性的抑制劑，通過Wnt通路介導MMP-13表達水平的下調[11]。

根據以往的實驗結果，非常有必要探索二者在漢族OA群體中是否有關聯，并且引起OA。本次研究結果表明對照組相比，OA組血清DKK-1水平降低，MMP-13水平明顯高，差異均有統計學意義。值得注意的是：無論是在男性亦或者在女性OA患者中，DKK-1水平顯著低于健康對照組，MMP-13相反高于對照組。提示S1P、MMP3參與了早期OA的發病。Spearman相關分析中，DKK-1和MMP-13的血清水平呈負相關。提示DKK-1水平高于正常對照組，當DKK-1表達減少，調控MMP-13抑制減弱，使MMP-13升高，最終導致OA發生。目前的發現與以往的研究結果一致[9]。

綜上所述，DKK-1的下降對MMP-13水平抑制性作用減弱，作用底物是II型膠原的MMP-13表達增多，致使II型膠原降解，使軟骨的拱形纖維結構破壞而受損，繼而關節軟骨破壞，加速骨關節炎關節軟骨退變。最終導致OA。因此了解DKK-1及MMP-13之間的關系可以為今后OA防治提供數據支持。

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