基于不同電化學探針檢測乳腺癌基因片段電化學傳感器的研究

賀彩梅，胡曉琴，劉舒萍，李曉霞

(延安大學 化學與化工學院,陜西 延安 716000)

乳腺癌是當前嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，發病率呈逐年上升趨勢。早期乳腺癌的治愈率可達95%以上，因此早期診斷極為重要。乳腺癌基因的過表達或突變往往預示著癌細胞的增殖[1]，因此，高靈敏檢測乳腺癌基因尤為重要[2]。

DNA電化學生物傳感器因靈敏、快速、簡便、不破壞測試樣品、不受溶液顏色影響、便于微型化等優點，近年來被廣泛用于臨床醫學、食品分析和環境監測等領域[3-5]。DNA電化學傳感器可分為標記型和非標記型兩種[6]。標記型DNA電化學傳感器靈敏度高，缺點是在標記過程中，涉及合成、標記、分離和純化等步驟，對DNA的活性可能產生影響。因此，非標記是DNA電化學傳感器的發展趨勢。常用的非標記DNA電化學傳感的檢測方法包括電流法、電位法、電容法和阻抗法。非標記電流法利用DNA堿基自身的電化學特性進行測定，但由于堿基的電位高，檢測靈敏度受到限制；另一種是選擇一類能與ssDNA和dsDNA相互作用的電化學活性物質作為電化學信號探針，對傳感器進行測定，不同的電化學探針測定DNA獲得的靈敏度不同。常見的電化學探針有陽離子金屬絡合物、小分子藥物及有機染料[7-8]等。

碳納米管是一類很重要的納米材料，具有表面積高、中空、化學穩定和導電性良好等特點，可作為電極修飾物或信號載體[9]。近年來碳納米管負載酶或納米粒子的信號放大作用，提高了DNA檢測的靈敏度[10-11]。金納米粒子具有良好的生物相容性，可以作為固定DNA的良好載體。

圖1 DNA電化學傳感器制備及目標DNA檢測的原理示意圖Fig.1 Schematic representation of the preparation of electrochemical DNA biosensors and hybridization detection of breast cancer gene

本文以荷負電鐵氰化鉀電對([Fe(CN)6]3-/4-)、荷正電的六氨合釕([Ru(NH3)6]3+)及有機染料亞甲基藍(MB)為電化學探針，構建了檢測乳腺癌BRCA1基因片段的電化學傳感器。首先將多壁碳納米管和Nafion的混合液超聲后修飾到金電極上，后利用電化學沉積法將金納米沉積到修飾電極上，增大了金電極的表面積，提高了DNA的負載量。然后基于靜電吸附作用，將乳腺癌BRCA1基因片段(乳腺癌ssDNA)固定到修飾電極上，制備乳腺癌DNA電化學傳感器(圖1)。選用3種不同的電化學探針，對乳腺癌目標DNA雜交前后進行定量檢測。結果表明，3種電化學探針中，鐵氰化鉀平衡電對探針檢測乳腺癌DNA的檢出限最低，線性范圍最寬；六氨合釕檢測乳腺癌DNA的靈敏度最高。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660型電化學工作站(天津市蘭力科電子高技術有限公司)。三電極系統：金電極或金納米/多壁碳納米管-Nafion/金電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑片電極為對電極。

多壁碳納米管(深圳納米港)；鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀(西安化學試劑廠)；亞甲基藍(中國醫藥公司北京采購站)；氯化六氨合釕、Nafion和6-巰基-1-己醇(Sigma-Aldrich公司)；氯金酸(國藥上海試劑廠)。所有乳腺癌基因片段DNA(上海生物工程有限公司)序列[12]如下:探針ssDNA:5’-GAG AAA CCC TAT GTA TGC TC-3’，互補目標DNA:5’-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TC-3’。單堿基錯配DNA:5’-GAG CAT ACA TTG GGT TTC TC-3’，五堿基錯配DNA:5’-GGG CAC ACA AAC CGTTTC TC-3’。

10 mmol/L PBS pH 7.0緩沖溶液為DNA儲備液。5 mmol/L K3[Fe(CN)6]- 5 mmol/L K4[Fe(CN)6]溶液：用0.10 mol/L PBS(pH 7.4)-0.10 mol/L KCl配制。20 μmol/L亞甲基藍(MB)溶液：用0.10 mol/L PBS(pH 7.0)緩沖溶液配制。50 μmol/L六氨合釕溶液([Ru(NH3)6]3+)：用10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4) 溶液配制。DNA序列在使用前經超速離心機離心5 min(8 000 r/min)，配成一定濃度的水溶液，在4 ℃冰箱中保存待用。實驗用水為Millipore Milli-Q超純水(大于18.2 MΩ·cm)。

1.2 DNA傳感器的制備

金電極預處理第一步參照文獻[13]。第二步將2 μL 1 mg/mL的多壁碳納米管和0.1%的Nafion-乙醇溶液混合，超聲分散均勻后滴涂到預處理好的金電極表面，記作多壁碳納米管-Nafion/金電極(MWCNT-Nafion/Au)；將MWCNT-Nafion/Au置于6 mmol/L氯金酸溶液中，在-200 mV恒電位下沉積80 s，獲得金納米/多壁碳納米管-Nafion/金電極(GNPs/MWCNT-Nafion/Au)。第三步將5 μL 1.0 μmol/L乳腺癌ssDNA溶液滴涂在GNPs/MWCNT-Nafion/Au表面,4 ℃下固定12 h，然后用10 mmol/L PBS(pH 7.0)和超純水分別沖洗，以除去未吸附固定的乳腺癌ssDNA。最后用1 mmol/L 6-巰基-1-己醇(MCH)封閉1 h，使DNA鏈的取向更加相對有序，減小非特異性吸附，提高雜交反應的效率。再用10 mmol/L PBS(pH 7.0)和超純水分別沖洗，制備得到DNA傳感器(ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/Au)。

1.3 目標乳腺癌DNA的分析測定

將5.0 μL目標乳腺癌DNA滴涂到DNA傳感器表面，37 ℃雜交反應1.5 h后，用10 mmol/L PBS(pH 7.0)和超純水沖洗，除去未參與特異性雜交反應的目標DNA。分別在5 mmol/L K3[Fe(CN)6] -5 mmol/L K4[Fe(CN)6]溶液、20 μmol/L MB溶液和50 μmol/L [Ru(NH3)6]3+溶液中進行循環伏安和差分脈沖伏安法研究。利用雜交前后電化學探針的電流差值(ΔI=ΔIdsDNA-ΔIssDNA)與目標乳腺癌DNA的濃度進行定量分析。

2 結果與討論

2.1 修飾電極的SEM與電化學表征

將MWCNT-nafion/Au及GNPs/MWCNT-Nafion/Au進行掃描電鏡觀察。從SEM圖(圖2A)可以看出電極表面的MWCNT呈線狀卷曲，均勻分布在電極表面。沉積金納米后，表面分散有顆粒狀的金納米(圖2B)，說明納米金沉積成功。

圖3 不同修飾電極的電化學阻抗圖Fig.3 Electrochemical impedance spectra of different modified electrodesa.bare gold electrode;b.MWCNT-Nafion/Au;c.GNPs/MWCNT-Nafion/Au;d.ssDNA/GNPs/MWCNT-Nafion/Au;e.ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/Au;f.dsDNA/ssDNA/MCH/GNPs/ MWCNT-Nafion/Au；cssDNA=1.0 μmol/L,cdsDNA=1.0 nmol/L

將金電極和GNPs/MWCNT-Nafion修飾金電極在1.0 mol/L H2SO4溶液中進行循環伏安掃描，掃描電位范圍在-0.2～1.6 V，掃速50 mV/s，測定0.9 V左右金的陰極峰峰面積(電量)，根據金表面電吸附氧形成單分子層AuO所需的雙電層電荷系數(0.386 mC/cm2)[14]，可以算出電極的真實面積。根據還原峰面積計算得到金電極的真實面積為1.3×10-2cm2，修飾金電極的真實面積為2.3×10-2cm2，增加約1.8倍。說明GNPs/MWCNT-Nafion復合材料修飾明顯增大了裸電極的比表面積。

圖3為不同修飾電極的電化學阻抗曲線圖。由圖3可知，裸金電極(曲線a)的阻抗譜高頻區出現了一非常小的半圓，說明其具有良好的導電性，電荷傳遞電阻Ret為201.2 Ω。電極表面修飾上多壁碳納米管和Nafion(曲線b)后，Ret減小至114.6 Ω，說明MWCNT-Nafion具有良好的導電性。當沉積上納米金時，曲線c幾乎成為一條直線，Ret減小至30.6 Ω，表明納米金粒子進一步促進了電子的轉移。當修飾電極表面固定上乳腺癌ssDNA時，曲線d高頻區的半圓明顯增大，Ret為443.6 Ω，表明探針DNA成功地固定到修飾電極表面。用MCH封閉修飾電極空余的未結合位點，曲線e半圓進一步增大，Ret為687.0 Ω。當目標乳腺癌DNA通過堿基互補的方式雜交到電極表面上，曲線f高頻區的半圓達到最大，其Ret為1 003.0 Ω，這是因為雙鏈DNA的磷酸骨架比單鏈DNA排斥帶負電荷的[Fe(CN)6]3-/4-能力強。以上結果表明，乳腺癌ssDNA通過靜電吸附作用固定在電極表面，構建的乳腺癌DNA傳感器與目標DNA發生了雜交反應。

圖4 不同電極的循環伏安曲線圖Fig.4 Cyclic voltammograms of different modified electrodesa.bare gold electrode;b.MWCNT-Nafion/Au;c.GNPs/MWCNT-Nafion/Au;d.ssDNA/GNPs/MWCNT-Nafion/Au;e.dsDNA/ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/Au；cssDNA=1.0 μmol/L,cdsDNA=1.0 nmol/L

圖5 不同濃度乳腺癌DNA在[Fe(CN)6]3-/4-探針中的微分脈沖伏安圖Fig.5 Differential pulse voltammograms of the different concentrations of breast cancer gene in 5.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-c(from a to h)：0,0.1,0.5,1.0,5.0,10.0,100.0,500.0 nmol/L；insert:calibration curve of target breast cancer gene

圖4為不同修飾電極的循環伏安曲線圖，由圖4可知，裸金電極具有良好的可逆性，峰電位差ΔE為80 mV(曲線a)。修飾上多壁碳納米管和Nafion溶液后，峰電流明顯增大，ΔE為98 mV(曲線b)。電化學沉積上金納米時(曲線c)，峰電流繼續增大，ΔE為79 mV。這是由于納米金修飾電極后，有效增大了電極面積，促進了電子在溶液和電極之間的傳遞。當乳腺癌ssDNA固定到修飾電極上時(曲線d)，由于電極表面的DNA膜和DNA磷酸骨架上的負電荷，使得[Fe(CN)6]3-/4-在電極上的電子傳遞速率受到抑制，所以ΔE增大，峰電流減小。乳腺癌ssDNA與目標乳腺癌DNA雜交反應后(曲線e)，形成雙鏈DNA結構，荷負電的磷酸骨架數量增多，進一步阻礙了荷負電的[Fe(CN)6]3-/4-向電極表面傳遞，ΔE進一步增大，峰電流繼續減小。循環伏安法與阻抗法表征的結果一致，說明DNA傳感器制備成功。

2.2 不同電化學探針在DNA傳感器中的應用

為了獲得較高的靈敏度，分別采用3種不同電化學探針(荷負電的[Fe(CN)6]3-/4-、荷正電的[Ru(NH3)6]3+和染料MB)作為檢測液，對目標乳腺癌DNA進行了分析測定。

2.2.1電化學探針[Fe(CN)6]3-/4-[Fe(CN)6]3-/4-因其良好的電化學行為和可逆性，被廣泛用于電極表征和電化學傳感器的研究[15]。電極上固定的ssDNA荷負電磷酸骨架對荷負電的[Fe(CN)6]3-/4-探針有靜電排斥作用，當ssDNA與目標DNA雜交反應后，雙鏈DNA對[Fe(CN)6]3-/4-探針的排斥作用更大，引起電流減小，基于此原理，用[Fe(CN)6]3-/4-探針對目標乳腺癌DNA進行定量測定。

圖5為不同濃度的目標乳腺癌DNA與電流的微分脈沖伏安曲線圖。在優化的實驗條件下，雜交前后的氧化峰電流變化值ΔI(μA)與目標乳腺癌DNA濃度(c，mol/L) 的對數logc在0.1～500.0 nmol/L范圍內呈良好的線性關系，線性方程為ΔI=16.34logc+174.12，相關系數為0.998 0，其檢出限(S/N=3)為0.03 nmol/L。對1.0 nmol/L的目標乳腺癌DNA進行7次平行測定，相對標準偏差為3.6%。

利用電化學交流阻抗法考察了DNA電化學傳感器與完全互補DNA序列、單堿基錯配DNA序列和五堿基錯配DNA序列雜交的電子傳遞阻抗變化情況。結果發現，電子傳遞阻抗變化值ΔRet分別為4 380、2 250、650 Ω。說明DNA傳感器與完全互補序列結合后對[Fe(CN)6]3-/4-的阻礙作用最大，也表明該傳感器能識別互補、單堿基錯配和五堿基錯配DNA序列，具有良好的選擇性。

2.2.2電化學探針MB亞甲基藍(MB)是具有芳香雜環結構的化合物，MB可以通過靜電吸附作用與磷酸骨架相結合，也能夠與鳥嘌呤(G)特異性結合。MB與單、雙鏈DNA的靜電吸附能力不同，可以選擇性地識別單、雙鏈DNA，常被用作電化學指示劑應用于DNA傳感器的研究[16]。

考察了ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/金電極和dsDNA/ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/金電極在20 μmol/L MB溶液中的循環伏安行為。結果顯示，當乳腺癌ssDNA與100 nmol/L目標乳腺癌DNA雜交后，MB的峰電流明顯增大，這歸因于MB與雙鏈DNA之間強大的吸附作用，使得更多的MB被吸附到雙鏈DNA上。表明MB可以用于目標乳腺癌DNA的測定。

圖6 不同濃度乳腺癌DNA在MB探針中的微分脈沖伏安圖Fig.6 Differential pulse voltammograms of the different concentrations of breast cancer gene in 20 μmol/L MBc(from a to g)：0,1.0,5.0,10.0,50.0,100.0,500.0 nmol/L；insert:calibration curve of target breast cancer gene

圖7 不同濃度乳腺癌DNA在[Ru(NH3)6]3+探針中的微分脈沖伏安圖Fig.7 Differential pulse voltammograms of the different concentrations of breast cancer gene in 50.0 μmol/L MBc(from a to g):0,1.0,5.0,10.0,50.0,100.0,500.0 nmol/L;insert:calibration curve of target breast cancer gene

在優化實驗條件下，發現雜交前后MB的還原峰電流變化值ΔI(μA)與目標乳腺癌DNA濃度的對數在1.0～500.0 nmol/L 范圍內呈良好的線性關系(圖6)，其線性方程為ΔI= 17.80 logc+172.95，相關系數為0.996 0；檢出限(S/N=3)為0.3 nmol/L，對1.0 nmol/L的目標DNA進行7次平行測定，相對標準偏差為3.9%。

2.2.3電化學探針[Ru(NH3)6]3+六氨合釕離子[Ru(NH3)6]3+是一種常用的電活性物質，與DNA骨架之間可以通過靜電力相互結合[17-18]。本研究基于ssDNA和dsDNA對[Ru(NH3)6]3+吸附量的不同，通過檢測電極表面吸附[Ru(NH3)6]3+的電流大小，對目標乳腺癌DNA進行分析檢測。考察了ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/Au和dsDNA/ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/Au傳感器在除氧、掃速為50 mV/s的條件下，于10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.40)-50.0 μmol/L[Ru(NH3)6]3+溶液中的循環伏安行為。結果發現-0.2 V和-0.3 V出現了1對氧化還原峰，這是[Ru(NH3)6]3+的特征吸收峰。當電極上固定了帶負電荷的DNA磷酸骨架，由于靜電吸附作用，使得[Ru(NH3)6]3+吸附在電極上，出現了[Ru(NH3)6]3+的一對氧化還原峰。雜交反應后，由于雙鏈荷負電吸附了更多[Ru(NH3)6]3+，使得電流增大。說明[Ru(NH3)6]3+探針可用于目標乳腺癌DNA的分析測定。

在優化實驗條件下，研究了所制備的DNA電化學傳感器對目標乳腺癌DNA樣品的DPV響應(圖7)。雜交前后[Ru(NH3)6]3+的還原峰電流變化值ΔI(μA)與目標乳腺癌DNA濃度的對數在1.0～500.0 nmol/L 范圍內呈良好的線性關系，線性方程為ΔI= 19.57logc+196.48，相關系數為0.996 0；其檢出限(S/N=3)為0.3 nmol/L，對1.0 nmol/L的目標DNA進行7次平行測定，相對標準偏差為4.2%。

3 結 論

本文基于3種不同的電化學探針對目標乳腺癌DNA電化學傳感器進行了研究。結果發現，鐵氰化鉀平衡電對為探針時乳腺癌DNA的檢出限最低，線性范圍最寬。使用六氨合釕檢測乳腺癌DNA的靈敏度高，但使用六氨合釕探針，實驗必須在氮氣保護下進行，且六氨合釕價格較貴，限制了該探針在DNA電化學傳感器中的廣泛應用。亞甲基藍是染料，價格較六氨合釕低，但極易吸附在電極表面，使得沖洗和處理電極非常繁瑣費時。

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綜上所述，留守生活不僅僅影響留守學生現在的心理健康，還對其人格的形成具有長遠意義，良好的人格對人一生的意義至關重要。因此對于留守兒童的關注不僅應放在其生活、學習及心理健康上，更應關注其人格的培養，這樣不僅有助于現階段的心理健康，還能更好地幫助其健康成長。留守兒童的人格是否在留守前后有較大改變以及心理健康教育和各種訓練對他們的人格有何影響，可進一步進行前瞻性的研究。

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