通過式固相萃取凈化/UPLC-MS/MS法測定特殊醫學用途配方食品中的13種非法添加化學成分

勵 炯，邱紅鈺，賈彥博，王紅青，李 瑋

(杭州市食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310017)

糖尿病是一種以胰島素分泌或作用缺陷引起的高血糖為特征的代謝性疾病,易引起患者的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂[1]。預計到2030 年，中國的糖尿病患病率將達11.6%，居各國之首，且以老年人為主，呈日益增多的趨勢[2]。目前，針對糖尿病患者的保健食品和特殊醫學用途配方食品(Food for special medical purpose,FSMP)種類繁多，常應用于糖尿病、呼吸系統綜合疾病、腎病、腫瘤、炎性腸病、食物蛋白過敏、肥胖、先天性代謝缺陷等病癥的營養輔助[3-4]。雖然近幾年國家衛計委出臺了《GB 29922-2013 特殊醫學用途配方食品通則》和《GB 29923-2013 特殊醫學用途配方食品良好生產規范》，國家食品藥品監督管理總局也于2016年7月1日實施頒布《特殊醫學用途配方食品注冊管理辦法》，進一步規范和管理FSMP的注冊，但相應的監督管理和法律責任等不完善。近年來已有很多文獻對中成藥和保健食品中非法添加的降糖類化學成分進行研究[5-7]，發現一些不法商家在利益驅動下，為了增強降糖效果，可能會在針對糖尿病人的FSMP產品中非法添加各種降糖類化學藥物，患者往往在不知情的情況下長期服用，造成不可挽救的后果。

目前，檢測化學降糖成分的方法主要有薄層色譜法[8-9]、高效液相色譜法[10-12]、毛細管電泳法[13]、離子選擇性電極法[14]、氣相色譜-質譜法[15]、液相色譜-質譜聯用法[16-18]，其中液相色譜-質譜聯用法兼具靈敏度高及抗干擾性強的優勢，廣泛應用于降糖類非法添加化學成分的定性確證。

樣品提取和凈化作為關鍵技術，會直接影響方法靈敏度和精密度，尤其是部分FSMP配料中脂肪或者磷脂含量較多，基質效應較明顯。前處理凈化方法多以普通的固相萃取小柱凈化，但其步驟繁瑣，操作不當易造成損失而影響定量準確性。本研究采用通過式固相萃取技術，以Oasis PRiME HLB 固相萃取柱凈化樣品，上樣前無需活化和平衡，樣液直接加載至SPE柱以吸附脂肪和磷脂類化合物，建立了針對糖尿病患者的特殊醫學用途配方食品中13種非法添加降糖類化學成分的通過式固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，方法靈敏、簡便、高效，可滿足日常特殊醫學用途配方食品的質量監測需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

美國Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6495串聯四極桿質譜儀、Milli-Q去離子水發生器(美國Millipore公司)、MS3旋渦混合器(德國IKA公司)。

對照品甲苯磺丁脲(批號90126，質量分數99.0%)購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；格列本脲(批號10135-200404，質量分數100%)、格列齊特(批號100269-201004，質量分數99.9%)、格列吡嗪(批號100281-200602，質量分數99.4%)、格列喹酮(批號100280-201002，質量分數99.3%)、格列美脲(批號100674-200301，質量分數99.1%)、馬來酸羅格列酮(批號100952-200701，質量分數99.5%)、瑞格列奈(批號100753-200501，質量分數99.8%)、鹽酸吡格列酮(批號100634-201202，質量分數100%)、鹽酸二甲雙胍(批號100664- 201203，質量分數100%)、鹽酸苯乙雙胍(批號100922-201001，質量分數99.7%)、格列波脲(批號520026-201401，質量分數99.9%)購于中國食品藥品檢定研究院；鹽酸丁二胍(批號1-RLJ-70-2，質量分數96%)購于Toronto Research Chemicals Inc.。冰乙酸、乙酸銨(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，德國Merck公司)；Oasis PRiME HLB 固相萃取柱( 6 mL中含200 mg，美國Waters公司)。

1.2 標準溶液的配制

分別精密稱取13種降糖對照品標準品各10 mg，分別用甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，作為對照品儲備溶液(質量濃度為1 000 mg/L)。分別精密吸取上述對照品儲備溶液適當體積于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配成2.0、5.0、10、20、50、100 μg/L的混合標準品系列溶液。

1.3 樣品前處理

取2 g樣品置50 mL聚氟乙烯離心管中，精密加入10 mL含1%甲酸的90%乙腈水溶液，加入2 g氯化鈉和5 g無水硫酸鈉，渦旋混合1 min，超聲提取20 min，5 000 r /min 離心5 min。取8 mL提取液直接加載到PRiME HLB 固相萃取柱上，流速為1滴/s，收集全部流出液。準確移取5.00 mL流出液，40 ℃水浴下氮吹至近干，精密加入0.5 mL 5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇(80∶20，體積比)，渦旋混勻1 min溶解殘渣，用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.4 色譜與質譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A為含0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～10 min，80%～20% A；10 ～10.1 min，20%～80% A ；10.1～13 min，80% A。柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min，進樣量1 μL；運行時間：13 min。

離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測方式(ESI+)；多反應檢測(MRM模式)；干燥氣溫度：200 ℃；干燥氣流速：14 L/min；毛細管電壓：3.5 kV；毛細管出口電壓(Fragmentor)：380 V；校準方法：質量軸自動調諧校正；MRM進行分段掃描：0～1.4 min，鹽酸二甲雙胍；1.4～2.4 min，鹽酸丁二胍；2.4～4.5 min，鹽酸苯乙雙胍；4.5～6.0 min，甲苯磺丁脲；6.0～7.0 min，格列吡嗪和格列齊特；7.0～8.8 min，馬來酸羅格列酮、格列波脲、吡格列酮、格列本脲和格列美脲；8.8～9.4 min，格列喹酮；9.4～13.0 min，瑞格列奈。其他質譜分析參數見表1。

表1 13種降糖類化學成分的質譜分析參數Table 1 MS parameters of 13 anti-diabetic drugs

*quantitative ion pair

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

精密量取質量濃度為0.5 mg/L的13種目標化合物標準溶液分別注入進樣器，隨流動相直接注入質譜儀進行母離子和子離子掃描。研究發現，13種降糖類化學成分在正離子模式下的方法穩定性和重復性較負離子模式好，故本方法采用正離子模式進行檢測。

在正離子模式下對13種降糖類化學成分進行母離子掃描，掃描范圍為m/z100～450，得到 [M+H]+峰。確定母離子之后，調節毛細管電壓，當毛細管電壓為3.5 kV時一級掃描響應最高。確定母離子及其條件后，繼續進行子離子掃描，以得到最佳的二級質譜條件，經儀器自帶的二級質譜參數自動優化程序，得到13種目標化合物的二級質譜優化參數(表1)。最終將優化后得到的定量定性離子對和碰撞能量作為13種降糖類化學成分的掃描參數。

圖1 13種降糖類化學成分(10 μg/L)的MRM譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 13 anti-diabetic drugs(10 μg/L)

2.2 色譜條件的優化

本文比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)、Waters CORTECS C18(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Kinetex C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm ) 4種色譜柱對13種降糖類化學成分色譜行為的影響。鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍和鹽酸丁二胍這3種雙胍類降糖成分，均為含氮類化合物，在色譜柱上易產生二次保留從而使色譜峰拖尾。結果表明，使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱時13種降糖類化學成分的色譜峰峰形較好，而采用其他3種色譜柱分析時，3種雙胍類成分均產生比較嚴重的色譜峰拖尾現象。這是因為Waters ACQUITY UPLC BEH色譜柱采用亞乙基橋雜化顆粒技術，可以保證目標物較好的峰對稱性、柱效以及化學穩定性，適用于最廣泛的化合物種類的通用性，在一定程度上解決了在質譜上較難分析雙胍類降糖成分的問題。

本文考察了甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液以及甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液3組流動相在“1.4”梯度條件下的色譜行為。實驗結果顯示：甲醇-0.1%甲酸水溶液的目標峰峰形較好，但靈敏度偏低；甲醇-5 mmol/L乙酸銨流動相的目標峰靈敏度明顯提高，但峰形拖尾。本文采用甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，此時13種目標物的峰形較好，靈敏度較高，MRM譜圖見圖1。

表2 正交試驗因素水平Table 2 Orthogonal test factors and levels

2.3 提取及凈化方式的優化

降糖類化學成分的提取溶劑一般采用甲醇、乙腈等，而一般通過式固相萃取法提取藥物殘留多采用乙腈為提取溶劑，在提取劑中加入一定比例的甲酸，有助于沉淀樣品中的蛋白質。本研究通過對提取劑用量、甲酸比例以及乙腈濃度(分別作為因素A、B、C)進行正交試驗優化(每個因素取3個水平，按照L9(33)正交表試驗)，比較10 μg/L加標水平下各因素組合的回收率和凈化效果，選擇最佳配比組合。正交試驗因素見表2。結果表明，使用10 mL含1%甲酸的90%乙腈水溶液為提取劑可以獲得良好的提取和凈化效果。

除了蛋白質，脂類物質也是主要的基質干擾物，本文采用通過式固相萃取技術，提取液經Oasis PRiME HLB 固相萃取柱凈化，上樣前無需活化和平衡，樣液直接加載至SPE柱以吸附脂肪和磷脂類化合物，不僅有效凈化了樣品溶液，而且顯著提高了樣品分析通量。

2.4 基質效應評估

本文通過基質效應來評價采用的通過式固相萃取技術的凈化效率?；|效應(ME)以基質標準曲線的斜率與溶劑標準曲線的斜率之比進行評估，基質標準曲線配制如下：分別取6份空白樣品2.0 g(檢測結果為陰性的降糖奶粉)于50 mL聚丙烯離心管中，分別精密加入混合對照品儲備溶液(質量濃度為1 mg/L)適量，按“1.3”方法制備基質標準曲線，配成最終質量濃度為2.0、5.0、10、20、50、100 μg/L的基質標準品系列溶液，按“1.4”條件進行分析，得到以降糖奶粉為基質的基質標準曲線，所得的基質標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的百分比進行評估。一般情況下，ME在85%～115%之間不存在明顯的基質效應，本文結果ME為88.4%～96.7%，所以本方法較好地消除了基質效應，保證了定性、定量結果的準確可靠。

2.5 線性關系、定量下限與重復性

取“1.3”方法配制的標準品系列溶液，分別進樣1 μL，以定量監測離子對的離子流中譜峰峰面積(Y)為縱坐標，標準品質量濃度(X，μg/L)為橫坐標進行線性關系考察，結果見表3。13種降糖類化學成分在2～100 μg/L范圍內線性較好(r2均大于0.99)。

取空白的降糖類奶粉樣品2.0 g，加入適當稀釋的混合標準品溶液，按“1.4”方法制備供試品溶液，分別以信噪比為3和10計算13種降糖類化學成分的檢出限(LOD)與定量下限(LOQ)，結果見表3。13種降糖類化學成分的最低檢出限為0.10～0.35 μg/kg，定量下限為0.3～1.0 μg/kg。

表3 13種降糖類化學成分的線性關系、檢出限和定量下限Table 3 Linear regression results，LODs and LOQs of 13 anti-diabetic drugs

2.6 方法回收率與精密度

取空白降糖奶粉樣品，每份稱取2.0 g，分別加入適量的混合對照品溶液，使供試品溶液最終加標水平分別為2、5、20 μg/kg，平行6份，按樣品制備方法制備供試品溶液，檢測含量，回收率結果見表4。13種降糖類化學成分的平均回收率為80.9%～102.8%，相對標準偏差(RSD)為2.6%～8.2%。

表4 特殊醫學用途配方食品中13種降糖類化學成分的回收率與精密度(n=6)Table 4 Recoveries and precisions of 13 anti-diabetic drugs in FSMP(n=6)

2.7 實際樣品檢測

利用本文建立的方法檢測了5批次降糖奶粉(分別為雅培益力佳SR營養配方粉、雅培怡?？禒I養配方粉、雀巢SUSTAGEN低GI營養配方奶粉、營養獅牌糖友寶配方奶粉和阿爾發牌富鉻奶粉)、2批次降糖餅干(分別為阿爾發牌降糖餅干和思朗牌無添糖消化餅干)和1批次降糖麥片(阿爾發牌消渴麥片)，結果顯示，13種降糖類化學成分均未檢出。

3 結 論

本研究建立了通過式固相萃取凈化/超高效液相色譜-串聯質譜法測定特殊醫學用途配方食品中13種非法添加降糖類化學成分的分析方法，優化了色譜質譜條件以及提取凈化條件。方法無需復雜的樣品前處理，樣品經含1%甲酸的90%乙腈水溶液提取，使用Oasis PRiME HLB固相萃取柱進行凈化處理，有效降低了基質效應，提高了分析方法的選擇性和靈敏度。

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