直接稀釋/電感耦合等離子體質譜法測定人血清中微量元素

孫傳強，龔子珊，郭廣宏，田亞平，趙學玒，汪 曣*

(1.天津大學 精密儀器與光電子工程學院，天津 300072；2.中國人民解放軍總醫院 生化科，北京 100853)

微量元素雖然在人體內含量不多，但對人的生命活動起著至關重要的作用，其攝入過量或不足均會不同程度地引起人體生理的異常或疾病發生。如Cu、Fe、Zn是人體必需的微量元素，是相關蛋白(金屬蛋白)和酶(金屬酶)的必要組成部分[1-2]，而長期暴露在高Al、Ga、As、Cd、Hg、Tl、Pb等元素的環境中會對人體造成巨大傷害[3-10]。因此，建立人體血清中微量元素準確有效的檢測方法，對考察人體內微量元素的含量水平至關重要。

目前可用于人體微量元素檢測的方法有原子吸收光譜法、原子發射光譜法、原子熒光光譜法、分子光譜法、X射線熒光光譜法、生化法、電化學分析法(電位溶出法)、電感耦合等離子體質譜法等[11-15]，在臨床醫學上廣泛應用的方法主要為生化法、電化學分析法、原子吸收光譜法，但生化法和電化學分析法結果的準確性差。原子吸收法是目前公認的比較優越的元素檢測方法，但其線性范圍窄、使用單一元素的檢測方式，難以滿足實際樣品中多種痕量元素同時檢測的需求。電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)是一種能夠實現多元素痕量檢測的分析技術，在人體微量元素臨床檢測方面有著廣闊的應用前景。

本文針對人血清樣品，使用直接稀釋的樣品前處理方法，選擇與人血清pH值、基質相近的堿性稀釋劑，通過優化儀器參數及檢測條件，實現了對人血清中部分有益元素、有毒有害元素共10種元素的同時檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

NexION 300D電感耦合等離子體質譜儀：美國鉑金埃爾默(Perkin Elmer)公司產品，配有四極桿碰撞/反應池(具有標準模式(無氣體)、碰撞模式(KED)、反應模式(DRC)3種工作模式可切換)。接口錐系統包括鎳制的采樣錐和截取錐，以及鋁制的超截取錐。儀器工作參數：ICP射頻功率1 600 W；冷卻氣流速為18 L/min，輔助氣流速為1.10 L/min,霧化氣流量0.98 L/min；跳峰掃描模式，駐留時間50 ms；Cu、Zn、Cd、Hg、Tl、Pb元素測量使用標準模式，Fe、Ga、As元素使用KED模式，碰撞氣為氦氣，Al元素使用DRC模式，反應氣為氨氣。

每次在進樣分析前需對儀器進行調諧校準，調諧方法如下：用質量濃度為1 μg/L的調諧液(Perkin Elemer公司)對儀器進行調諧，當信號強度Be>2 000 counts/s，In>40 000 counts/s，U>30 000 counts/s，背景噪聲在質量數220處響應值≤1，氧化物產率CeO+/Ce+≤2.5%，雙電荷產率Ce2+/Ce+≤3%時，認為儀器調諧通過，可以正常工作。

1.2 主要材料與試劑

超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)是由Milli-Q Advanced A 10系統(Millipore公司，美國)制備得到；混合元素標準儲備液(Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、Tl、V和Zn，100.0 μg/mL)由國家有色金屬及電子材料分析測試中心提供；Hg、Rh、In、Bi單元素標準溶液(1 000 μg/mL)由國家鋼鐵研究總院提供；調諧液(Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb和U，1%HNO3介質，1 μg/L)，TritonX-100由珀金埃爾默(PerkinElmer)公司提供；正四丁基氫氧化銨(體積分數為40%)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，高純)購自Alfa Aesar公司；ClinChek?-Control人血清標準物質購自德國Recipe公司。

稀釋劑成分：0.5% 正四丁基氫氧化銨溶液、0.3% TritonX-100和0.5% EDTA，其他成分為超純水。將混合標準儲備液用稀釋劑稀釋100倍，得到質量濃度為1 000 μg/L的母液，使用時逐級稀釋為系列標準溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1標準曲線的建立首先對人血清分析物進行半定量分析實驗。半定量分析的準確度較差，存在±30%的誤差，僅用于預估標準曲線工作范圍。經分析，各元素的標準溶液濃度梯度設定為Fe、Cu、Zn元素：5、10、20、50、100 μg/L；Al、Ga、As、Cd、Tl、Pb元素：0.05、0.1、1、5、10 μg/L；Hg元素：0.05、0.1、0.5、1、2 μg/L。

1.3.2樣品處理健康成年人血清樣本由中國人民解放軍總醫院提供。人血清樣本保存在-18 ℃下，用時提前置于室溫解凍，振蕩均勻后，取一定量的人血清樣品，用稀釋劑稀釋10倍，混勻待測。

2 結果與討論

2.1 質譜干擾

為消除多原子離子的干擾，對碰撞/反應池條件進行了優化，包括碰撞氣體流速、反應氣體流速以及RPq值(即多極桿工作參數)，優化后的條件如表1所示。實驗發現，氨氣反應模式下適合Al元素的檢測，而氦氣碰撞模式有利于消除ArO、ClO2、ArCl等多原子離子對Fe、Ga和As元素的干擾，其他元素用標準模式即可。

表1 碰撞反應池參數設置Table 1 The parameters of collision/reaction cell(CRC)

2.2 內標元素的選擇

內標元素的選擇主要基于分析元素的質量數和電離能，一般選擇質量數和電離能與分析元素相近的元素作為內標。為了更好地校正非質譜干擾，本實驗使用多種內標元素進行校正。Sc常用以校正低質量數的元素(質量數為6～70)，但在本實驗中發現，Sc作為內標的測試結果不穩定，可能與檢測的樣品基體復雜有關，因此選擇Rh元素校正低質量數的元素(Al、Fe、Ga、Cu、Zn、As)，In元素校正中間質量數的元素(Cd)，Bi元素校正高質量數的元素(Hg、Tl、Pb)。

2.3 方法線性、檢出限與定量下限

本研究考慮到人血清中待測元素濃度差異，配制3套低高濃度元素標準溶液，質量濃度范圍如“1.3.1”所述。先后進樣各套濃度標準溶液，以標準溶液各元素質量濃度(X,μg/L)為橫坐標，離子計數值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。結果如表2所示，所有元素的線性良好，相關系數不小于0.999 6，可以滿足微量元素準確定量分析的需求。

表2 線性相關系數、檢出限、定量下限及回收率Table 2 Correlation coefficient,detection limits，quantification limits and recovery

通過獨立測量11次空白溶液的信號強度，以其標準偏差乘以3并反演濃度求得方法的檢出限(LOD)，其標準偏差乘以10并反演濃度求得定量下限(LOQ)，實驗結果列于表2。10種待測元素的LOD為0.9 ng/L～0.346 μg/L，LOQ為0.003～1.142 μg/L，均遠低于正常人血清中各元素含量。

2.4 加標回收率與精密度

實驗根據分析元素在樣品中的含量差異，不同元素設置不同的加標量，一般加標量為待分析元素含量的0.5～2.0倍，計算得各元素的加標回收率為87.2%～111.2%(表2)。

表3 人血清標準物質的檢測結果Table 3 Results of trace elements in human serum standard from ClinChek?-Control

通過6次獨立實驗，計算濃度結果的相對標準偏差(RSD)求得精密度。對于Ga、As、Cd、Hg、Tl、Pb等含量較低的元素，精密度的測量是通過向實際樣品中加入1 μg/L分析元素的標準物質，計算檢測濃度結果的RSD求得，結果見表2。其中，日間RSD為2.0%～8.7%，相較于日內RSD(0.7%～6.9%)略差，推斷是樣品中殘留蛋白沉淀導致待測元素濃度測量的日間變異。

2.5 人血清標準物質分析

為進一步驗證方法的準確性，采用本方法對人血清標準物質ClinChek?-Control Serum Control lyophilized level Ⅰ和level Ⅱ中相應元素進行了測定，實驗結果如表3所示。對比測定值和標準物質給出的參考范圍可以看出，測定值均在給定的參考范圍內，本方法能夠對人血清樣品中微量元素進行準確定量分析。

2.6 人血清實際樣本檢測

本研究共采集血清樣本127例，被采血者為體檢各器官功能正常、無疾病的健康成年人。按照不同年齡段，將樣本分為21～35歲組(23例)、36～50歲組(60例)、51～65歲組(44例)，并按性別將36～50歲組(60例)分為兩組，其中男性19例，女性41例。在優化條件下進樣分析，檢測結果如表4所示。人體內部分元素含量低于定量下限，按照通用的生物學檢測和調查方法，以1/2 LOQ作為該元素的估算值。

表4 不同年齡段的健康成年人血清中微量元素含量的平均值和范圍，以及不同性別健康成年人血清中微量元素含量平均值Table 4 Mean value and range of elements concentrations in serum from healthy adults of three age groups,and mean value of elements concentrations in serum from healthy adults of different sex groups

a.μg/L,b.mg/L

Fe、Cu、Zn是對人體有益的痕量元素，并被我國的各級醫療保健單位作為人體元素檢測的常規項目。由表4可知，Fe、Cu、Zn含量隨著年齡的增長呈降低的趨勢。女性血清中銅的含量略高于男性。鐵是常見的受性別影響較大的元素，女性體內鐵含量常低于男性，與文獻報道結果相符[16]。

對于Al、As、Ga、Hg、Tl等有毒有害元素，Al的含量隨著年齡的增長呈增加趨勢，說明Al在人體內有一定的累積作用，而As、Ga、Hg和Tl在各年齡段的含量無明顯趨勢。另外，實驗發現Pb、Cd元素在女性測試者體內含量明顯高于男性，具體成因尚未明確。

3 結 論

本文建立了直接稀釋/ICP-MS方法，用于測定人血清樣品中10種微量元素，包括有益元素(Cu、Fe、Zn)和有毒有害元素(Al、Ga、As、Cd、Hg、Tl、Pb)。實驗中采用的直接稀釋法，較常規消解方法，大大簡化了前處理過程，縮短了樣品的分析時間，有效地避免了復雜樣品前處理帶來污染的可能[17]。同時，樣品需求量少，適用于臨床微量元素檢測。針對不同分析元素，使用混合內標校正，測定結果更為準確。實驗分析了不同年齡段、不同性別的健康成年人血清樣品中的微量元素，并給出了參考均值和濃度范圍，為構建人群微量元素大數據、探討微量元素與疾病的關系提供了一種準確有效的檢測方法。

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