條件培養基對大鼠慢性脊髓損傷后膠質GFAP表達的影響實驗研究

張 鵬 吳翠瑩 曾 旭 劉 寧 張鵬飛 戴宜武 秦家振

解放軍陸軍總醫院，北京 100700

隨著世界各國經濟水平的發展，交通工具與城市建設飛速發展，同時帶來脊髓損傷的發生率呈現逐年增高的趨勢。脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是由于外界直接或間接因素導致脊髓損傷，在損害的相應節段出現各種運動、感覺和括約肌功能障礙，肌張力異常及病理反射等的相應改變，不僅給患者本人帶來身體和心理的嚴重傷害，還對整個社會造成巨大的經濟負擔。尤其是慢性脊髓損傷，由于其治療效果較差，備受各國研究人員的重視。

近年來，隨著干細胞技術的發展，干細胞移植治療 SCI 已成為熱點，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）為來源于中胚層間充質的成體干細胞，具有易于獲取，無倫理學爭議，增殖能力較強，易于體內外擴增等特性，除此之外，MSCs還具有免疫調節，促進神經軸突和血管再生等作用[1-2]。然而，間充質干細胞移植也有諸多不利：如無法長期存活、存在部位無法固定等。而間充質干細胞的條件培養基（BMSC-CM）因含豐富的細胞因子，對多種疾病均有積極的治療效果[3-4]。

本實驗通過觀察動物行為學并進行免疫組化學檢測得知，BMSC-CM能夠在較大程度上影響慢性脊髓損傷后膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達[5]。并對大鼠慢性脊髓損傷后的功能恢復具有重要作用，現報道如下。

1　資料與方法

1.1　一般資料

隨機選取脊髓神經損傷研究實驗室84只雄性Wistar大鼠，兩組大鼠均為慢性脊髓損傷，依據大鼠的受傷情況并運用隨機數字表法將其分為對照組與觀察組。對照組與觀察組大鼠數量分別為42只，樣本來源于受傷后 1、4、11、21、35、60、90d 等不同時期。

1.2　方法

（1）制作慢性壓迫性脊髓損傷模型。手術前將大鼠固定在手術架上，并對其注射45mL的戊巴比妥鈉麻醉藥劑就行麻醉。以T13為中心切口，將大鼠受傷的脊髓進行切除，并將3mm長、0.5mm螺距的塑料釘嵌入大鼠的脊髓，使其脊髓受到10%的壓力，之后每隔一天便重復此操作，直至受壓程度達到40%，最大的受壓程度可達到50%。

（2）BMSCs的培養及BMSC-CM的收集。BMSCs的原代分離培養：使用2%戊巴比妥鈉（批準文號：國藥準字H31021725，2010-08-17，生產單位：上海新亞藥業有限公司）麻醉大鼠，無菌條件取股骨及脛骨，PBS清洗3次。剪掉股骨和脛骨的骨骺端，暴露骨髓腔，用含青、鏈霉素的DMEM培養基沖出骨髓，反復吹打；將沖出的骨髓制成單細胞懸液。將沖洗下來的液體制成單細胞懸液，經Percoll密度梯度離心法，分離和收集有核細胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基重懸離心管中的細胞，鏡下細胞計數，使細胞密度達到1×106個/mL，CO2培養箱培養，換液，將骨髓間充質干細胞不斷傳代、純化，得到BMSCs。BMSC-CM的收集：純化后的BMSCs，收集每次換液的培養基，經1500rpm離心去除細胞碎片后，放置與-80℃冰箱保存。

（3） ELISA操作過程（參考廠家試劑盒步驟）。①向96孔板加入100μL×稀釋液，作為陰性對照。同時加入所測因子的標準品100μL到96孔板。②將所測樣品100μL加到96孔板，每個樣品2個微孔。③室溫下孵育2h，注意用錫紙包裹96孔板避光。④孵育后將每個孔內的液體吸掉，然后每孔用400μL×沖洗液洗滌4次，每次1 ～ 2min，最后一次時將96孔板翻轉置于吸水紙上。⑤每個微孔加入200μL酶標檢測抗體，用封板膠紙封住反應孔，室溫下孵育2h。⑥孵育后將每個孔內的液體吸掉，然后每孔用400μL ×沖洗液洗滌4次，每次1 ～ 2min，最后一次時將96孔板翻轉置于吸水紙上。⑦加入200μL顯色底物（顯色劑A和顯色劑B各100μL），室溫下孵育30min，從最后一個微孔加樣后開始計時。⑧加入50μL終止液，孔內溶液顏色會從藍色變成黃色。⑨30min內進行檢測，用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中生長因子的含量。計算 VEGF， bFGF，TGF-β， HGF， IL-6 的濃度。每個樣品重復四次，每組取三個樣品。

（4）進行免疫組織化學檢測。對切除的脊髓浸泡后進行脫水與石蠟密封工作，當進行免疫組織化學檢測工作時，采用SABC法，首先利用濃度為3%的過氧化氫對蠟片進行清洗，以此對蠟片進行殺菌工作；其次將蠟片放入0.01mol/L枸櫞酸鹽溶液中進行加熱，在常溫環境下待蠟片冷卻后滴入抗原修復液，隨后將其放入冰箱中冷藏約8 ～ 10h，將冰箱溫度設定為3.5℃。最后，將蠟片從冰箱中取出并加入二抗生物素化羊抗鼠IgG，進行約30min的孵育以此來使脊髓樣本中的膠質纖維酸性蛋白恢復活性，加入二氨基聯苯胺與蘇木素等顯色劑在顯微鏡下進行觀察。試驗過后利用中性樹膠對蠟片進行再次密封。上述采用的所有步驟之間均需使用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液進行沖洗，并利用PBS代替一抗作為陰性對照。

（5）免疫熒光染色。將切片以 4%多聚甲醛固定 30min。用含 0.3% 或0.1%Triton X-100+10% BSA的 PBS 封閉非特異性染色。然后與一抗（anti-GFAP）4℃孵育過夜。沖洗后加入與一抗相對應的熒光二抗，室溫孵育 1h，沖洗。用含 DAPI的封片劑（Vector Lab）封片后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.3　觀察指標

（1）觀察原代培養的骨髓間充質干細胞的培養及條件培養基情況。（2）觀察兩組大鼠的免疫組織化學檢測結果。（3）觀察兩組大鼠的組織病理變化。（4）觀察兩組大鼠的生物行為學變化。

1.4　統計學處理

本次研究的所有數據將被錄入至EXCEL中，采用 SPSS13.0 軟件進行統計學處理，計量資料應用（x±s）表示，組間比較行t檢驗，計數資料采用（%）表示，行χ2檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

表2　兩組大鼠的免疫組織化學檢測結果比較（±s ）

表2　兩組大鼠的免疫組織化學檢測結果比較（±s ）

組別　n　　脊髓損傷前脊髓損傷后1d　4d　11d　21d　35d　60d　90d對照組　42　153.18±18.03　131.87±15.12　120.27±9.82　115.21±13.08　102.37±11.93　114.09±14.21　121.07±13.57　124.58±15.16觀察組　42　153.18±18.03　126.04±12.31　（133.24±10.29）　　（135.24±9.06）　　（169.25±9.61）　152.64±12.86　139.24±11.23　114.69±15.41 t 5.909　8.158　28.293 p 0.000　0.000　0.000

表3　兩組大鼠的BBB評分比較（分）

2　結果

2.1　原代培養的BMSC-CM中細胞因子含量的檢測結果

原代培養的 BMSCs 傳至第二代時，細胞形態為長梭形的纖維狀，折光性好（圖 1）。我們用酶聯免疫吸附法測定CM內多種因子VEGF， bFGF，TGF-β， HGF， IL-6的含量，結果如表 1。從檢測結果來看，CM中含bFGF（16.51±3.70）pg/mL、VEGF（67.86±6.86）pg/mL、TGF-β（74.23±8.08）pg/mL、HGF（119.72±7.59）pg/mL、IL-6（92.15±6.42）pg/mL等多種細胞因子。

圖1　原代培養的骨髓間充質干細胞（標尺為30μm）

表1　Elisa檢測骨髓源間充質干細胞條件培養基內分泌的細胞因子含量

2.2　對照組大鼠與觀察組大鼠的免疫組織化學檢測結果比較

觀察組大鼠在受傷后其GFAP平均灰度值便開始上升，在第21d時其水平升到最高值，隨后便開始逐漸下降。通過使用BMSC-CM，受傷第90d后其GFAP平均灰度值小于對照組大鼠，同時兩組大鼠在受傷后第4，11，21天時GFAP平均灰度值差異較大，具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3　觀察組大鼠與對照組大鼠的生物行為學變化比較

觀察組大鼠的神經功能恢復時間明顯短于對照組大鼠，同時在第11天與21天的BBB評分差異明顯，具有統計學意義（P＜0.05），見表3。

2.4　對照組大鼠與觀察組大鼠的兩組大鼠的組織病理變化

對照組大鼠在脊髓受傷后第1天開始，其GFAP含量便開始上升，在進行脊髓壓迫手術后，隨著時間的延長，其神經元開始逐漸萎縮，并產生炎性細胞浸潤現象。然而對于觀察組大鼠而言，雖然受傷后第1天的GFAP含量也會上升，但是上升速度卻慢于對照組大鼠，同時病變的情況要輕于對照組大鼠，見圖 2、3。

圖2　對照組大鼠受傷60d后 GFAP表達情況（標尺為25μm）

圖3　觀察組大鼠受傷60d后GFAP表達情況（標尺為25μm）

3　討論

脊髓對于任何生物而言都是極其重要的神經組織，一旦受到損傷便會對生物體產生不良影響，因此必須及時采取有效的措施進行治療[6]。BMMSCs是具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，隨著研究的深入，MSCs 的旁分泌作用越來越引起大家的關注，大量研究表明，MSCs 分泌的多種因子具有較好的促進創傷愈合和功能恢復的治療效果[7-8]，其分泌的一些分子已經證明具有抗凋亡和刺激細胞增殖的作用，例如血管內皮生長因子（VEGF）可誘導內皮細胞的增生、遷移，促進血管發生；成纖維細胞生長因子（bFGF）可誘導內皮細胞的增生；轉化生長因子（TGF-β）可促進血管成熟；肝細胞生長因子（HGF）可抑制CD4+T細胞增殖，調節免疫；白介素6（IL-6）可調節炎癥、誘導VEGF的分泌等[9-10]。BMSC-CM的作用機制主要是通過抑制細胞死亡，減輕炎癥反應，促進血管再生而實現對受損組織的修復。

脊髓損傷早期，膠質瘢痕成份主要為小膠質細胞、少突膠質細胞、巨噬細胞和星形膠質細胞等；損傷后期，小膠質細胞、少突膠質細胞和巨噬細胞逐漸被星形膠質細胞所代替，成份較單一[11]。星形膠質細胞的胞體體積較大，多角形，細胞核圓形或卵圓形，由胞體向四周發出幾個放射狀突起。GFAP是一種酸性蛋白，分子量為50～52KD，屬細胞骨骼蛋白，是星形膠質細胞的標志蛋白，其表達的高低可側面反映星形膠質細胞增殖、肥大、壞死等改變的程度與膠質細胞的功能狀態[12]。脊髓損傷后GFAP的表達逐漸增強，其高表達的區域即為膠質瘢痕富集區[13]，本項實驗結果表明，通過對觀察組大鼠注射BMSC-CM，使得體內的星形膠質細胞的生長得到了抑制，進而在較大程度上降低了GFAP含量，使得大鼠在受傷21d左右便恢復了脊髓組織的正常功能[14]依據研究結果可知，兩組大鼠在第21天時BBB評分差距最大，并且隨后觀察組大鼠的GFAP含量不斷降低，因此使得大鼠逐漸恢復健康；同時也在較大程度上為受傷的脊髓神經提供了充足的營養，幫助神經元快速修復[15-18]，能夠有效的恢復大鼠的四肢功能，避免留下不良的后果，進而能夠有效的提升大鼠的預后質量。除此之外，由于在脊髓受傷后GFAP的含量值上升較慢，也在在較大程度上降低了術后神經元萎縮的速度，進而使得炎性細胞的浸潤速度減緩，因而觀察組大鼠能夠在較短時間內得以恢復。通過上述結果可充分表明，BMSC-CM能夠有效的修復大鼠受傷的脊髓組織[19]，并降低慢性脊髓損傷后GFAP的表達量，對于大鼠而言具有重要作用[20]。產生上述結果的總體原因在于GFAP的表達量受到了嚴重的抑制，因而其含量不斷降低，避免了炎癥細胞因子的產生，進而縮短了恢復時間。

綜上所述，我院認為使用BMSC-CM能夠有效的降低大鼠慢性脊髓損傷后GFAP表達量，同時提升BBB評分，進而使受傷大鼠快速恢復健康。通過大鼠實驗表明，BMSC-CM對脊髓損傷后功能的恢復，具有重要的臨床意義。本次研究樣本容量有限，今后仍需大樣本隨機進一步觀察。

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