三七總皂苷對腦損傷模型大鼠神經行為學 損傷區VEGF及FGF表達影響的研究

張令春 褚延樂 王夢妮

1)河南省人民醫院臨床藥學科，河南 鄭州 450003 2)鄭州大學第二附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450014 3)鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450001

急性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是腦外科最常見的疾病之一。近些年來由于經濟的飛速發展導致建筑意外、交通事故以及跌打損傷等引起的顱腦損傷也日漸增多。顱腦損傷患者的病死率極高，即使存活下來，也會給幸存者帶來不同程度的殘疾和心理問題[1]，這些問題會直接或影響其工作和社會行為，給患者的生活質量造成嚴重威脅，同時對這類患者的康復治療照顧也會給社會帶來沉重負擔。因此，創傷性顱腦損傷救治的重大課題就是改善患者的生存質量，降低殘疾和病死率?；颊咴谑艿絼搨燥B腦損傷后會發生一系列復雜的生理病理變化[2-4]，除了暴力造成的急性的神經元及膠質細胞的直接損傷、血管破壞等機械性損傷以外，還包含由于微環境改變而導致的細胞因子改變從而觸發的級聯反應所引發的繼發性損傷(包括缺血、缺氧、自由基損傷、離子失衡、炎癥反應和細胞凋亡等)，這兩種損傷結合引起 TBI患者腦微循環變化，引起患者腦細胞的生理功能的異常變化。因此，防止微循環障礙、促進損傷區微循環修復，是常用的治療手段。但是，臨床上傳統的擴容及使用自由基清除劑、Ca+拮抗劑等治療方法則效果欠佳。

三七在我國常常被用于治療缺血性腦卒中，它具有消痛散瘀的作用。中藥三七中最主要的化學成分是三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PHS)，其主要作用是增加腦血流量，降低血黏度，抑制血小板聚集從而改善微循環[5]。因此，近年來三七總皂苷被廣泛用于治療心腦血管疾病。有研究表明，顱腦損傷后，應用三七總皂苷能夠緩解腦水腫，改善血腦屏障的通透性，從而起到腦保護作用[6]。但是，目前對PNS治療創傷性顱腦損傷的作用機制還不是特別清楚。本研究所采用大鼠創傷性顱腦損傷模型由自由落體法實現，采用PNS對模型進行干預，采用神經行為學評分對治療結果進行評價，Western blot法檢測大鼠海馬區不同時間點的促血管生成因子VEGF及FGF表達的變化，探討PNS修復創傷性顱腦損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料購買自河南省實驗動物中心SPF級成年雌性Wistar大鼠60只，體質量為(200±5)g；注射用血塞通凍干針劑(PNS，規格：120 mg；昆明制藥集團股份有限公司)；FGF抗體、VEGF抗體(Santa Cruz)。

1.2方法

1.2.1 TBI損傷模型制作：大鼠中度創傷性顱腦損傷模型采用 Feeney 自由落體硬膜外撞擊法建立[7]。具體操作方法：采用10%水合氯醛對各組大鼠行腹腔注射(2 mL/kg)麻醉，頭部備皮后將其固定于腦立體定向儀上，常規消毒和鋪巾后，沿中線切開大鼠的頭頂部皮膚，采用鈍性分離對皮下組織進行分離，切開骨膜之后分離，并用牙科磨鉆出骨窗，值得注意的是在操作過程中要盡量保證硬腦膜的完整性。具體操作方法：把撞擊圓錐頭端置于骨窗上，將砝碼從距離骨窗35 cm的高處自由垂直落下，使之撞擊硬膜上的圓錐，以形成中度腦損傷[8]。建模之后清理創傷面、止血，應用骨蠟將骨窗封閉，縫合。術后腹腔注射注射左氧氟沙星。對照組和治療組在模型制作完畢后經腹腔分別注射 100 mg/mL生理鹽水和此前制備好的PNS溶液100 mg/mL。在注射過程中，要密切注意大鼠的生理變化，術后需要單籠飼養。若實驗過程中因操作和其他并發癥引起死亡時，則去除該大鼠的所有實驗數據，同時要注意補充新的大鼠，并記錄其實驗數據。將60只Wistar大鼠隨機分為假手術組(切開頭部皮膚，顱骨鉆孔后不損傷腦組織不治療)，治療對照組(制作中度創傷性顱腦損傷模型成功后行腹腔注射生理鹽水)及PNS治療組(制作中度創傷性顱腦損傷模型成功后行腹腔注射PNS，劑量100 mg/kg)。見圖1。

圖1 動物模型制作：A大鼠腦損傷模型制作；B大鼠中度創傷性損傷后

1.2.2 神經行為學評分：大鼠麻醉蘇醒后，單籠飼養，分別于損傷后的第3天和第7天的固定時間點從每組中取出10只大鼠，大鼠的神經運動感覺功能的系統評估主要采用改良的神經損傷程度評分量表(modified neurological severity scores，mNSS)來進行評估[9-11]。評分采用雙盲法，具體操作方法：由熟知mNSS評分的2名不知情的實驗員對各組大鼠的運動、感覺、平衡以及反射進行測試，并詳細記錄數據。評分表總分為0～18分，重度損傷為13～18，中度損傷為7～12分，輕度損傷為1～6分，正常大鼠的評分為0分。大鼠的神經功能采用運動、感覺、平衡4個方面來評價。

1.2.3 western blot檢測：不同時間點損傷處組織VEGF及FGF表達變化，術后7 d將大鼠麻醉后固定于手術臺上，無菌條件下分離腦組織，以損傷處為中心，截取大鼠腦組織約2 mm3，用預冷的生理鹽水沖洗數次后置于凍存管中并快速存放于液氮中備用。RAPI裂解組織后12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，BCA法測量蛋白濃度，后經聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉膜1.5 h，后置于50 g/L的脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h，VEGF一抗(1：1 000稀釋)、FGF一抗(1：800稀釋)過夜孵育，用TBST溶液洗膜3次后于辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗溶液中室溫下孵育2 h，TBST溶液洗膜3次，顯影成像，最后用Image J軟件進行蛋白灰度分析。

1.3統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行數據處理。采用重復測量數據的方差分析比較各組大鼠mNSS評分以及VEGF及FGF蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1大鼠神經損傷程度評分結果在模型大鼠進行治療后的第3天特定時間點對各組大鼠進行 mNSS評分，結果顯示，在PNS治療后3 d內各手術組間差異不顯著，且假手術組大鼠行為學表現正常；在治療后第7天的同一時間點對各組大鼠進行 mNSS評分，對照組的評分則高于治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠 mNSS 評分比較分)

2.2損傷組織中VEGF及FGF表達變化Western blot結果顯示，術后7 d時對照組與治療組中VEGF蛋白及FGF蛋白的表達均高于假手術組，與對照組相比較治療組中VEGF的表達明顯升高(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 SCI后28 d 各組大鼠脊髓組織蛋白表達比較

表2 TBI 7 d后VEGF、FGF蛋白在各組大鼠腦組織中的表達變化

注：與假手術組相比，*P<0.05；與對照組相比，#P<0.05

3 討論

三七總皂苷是三七中的有效活性成分，具有活血化瘀，消腫止痛的功效。實驗研究表明，三七皂苷能夠保護心腦血管缺血缺氧損傷，且能夠抑制腦神經細胞的凋亡[12-15]。

隨著經濟的高速發展，車禍和建筑意外導致的腦損傷數量不斷增加[16-17]。由于引起腦損傷的創傷包含機械損傷外，還有繼發性的腦損傷，二者都會引起腦損傷患者腦部微循環的變化。損傷的血管內皮細胞及其形態的變化可引起患者血管管壁組織結構的變化，進而導致局部血液流變出現變化，引起微循環障礙[18-20]，微循環障礙是局部微環境損傷的重要病理生理基礎，也是影響患者神經恢復的重要因素。

VEGF在腦組織內有比較豐富的表達，還是生成血管的關鍵調節因子，特異地作用于血管內皮細胞，改善和幫助恢復損傷腦組織的血液供應，是效果最好的促血管生長因子之一。VEGF有強大的促進新生血管形成的能力，且能有效促進傷口的愈合[21-22]。VEGF也是目前挽救和治療缺血性腦血管疾病和缺血半暗區腦組織功能損傷的關鍵所在。近些年對VEGF與中樞神經系統的諸如阿爾茲海默、帕金森等其他疾病之間的關系的研究也越來越多[23-24]，這足以看出VEGF具有巨大的應用前景。已有研究表明，PNS能夠降低大鼠血小板聚集率，延長其頸總動脈血栓形成的時間，具有抗血栓作用[25]。本研究從神經行為學上證實，模型組大鼠經PNS治療后神經行為獲得較為明顯的改善，為PNS向臨床應用提供了一定的依據。治療組大鼠顱腦損傷區域VEGF蛋白表達明顯高于假手術組和對照組(P<0.001)，該研究表明PNS在一定程度上能夠促進大鼠損傷腦區域的VEGF的表達。

FGF有促進新生血管形成、提高腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性、增加腦血流量、抑制一氧化氮(NO)產生等功能，因此能夠促進腦損傷患者的恢復[26-28]。本實驗表明，PNS 治療組大鼠損傷區FGF蛋白表達也明顯高于假手術組和對照組(P<0.001)，說明PNS 能夠促進大鼠損傷腦組織中FGF的表達。

綜上，PNS可以增加顱腦損傷大鼠腦損傷區域VEGF及FGF的表達量。該研究不僅為PNS治療顱腦損傷提供了科學的實驗依據，也開拓了臨床治療顱腦損傷的新思路，也為以后進一步研究VEGF和FGF的腦保護機制提供了線索。

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