62株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的同源性分析

何 磊，邱景富

(重慶醫科大學，重慶 400016)

鮑曼不動桿菌 (Acinetobacterbaumannii，AB)屬于非發酵革蘭陰性球桿菌，營養要求不高，易存活于各類非生物體表面[1]，在醫院各類環境中廣泛存在[2-3]，尤其是各類重癥監護病房(intensive care unit,ICU)。近年多次報道AB在醫院內引起流行和暴發[4-6]。AB耐藥形勢嚴峻，2015年CHINET中國細菌耐藥監測網數據顯示，AB對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為62.00%、70.50%[7]，故耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii,CRAB)給臨床防治帶來極大困難，需要對其傳播途徑和同源性進行研究。了解傳染源及傳播途徑，采取相應的措施有效控制AB醫院流行和暴發[8]。本研究采用脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)技術對中國西南某區縣三級甲等醫院某時段分離的CRAB進行同源性分析，結合臨床資料進行流行病學分析，以期提出更精準的防控措施。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 某三甲綜合醫院2015年8月—2016年11月住院患者各類臨床標本分離的62株CRAB，剔除同一患者長期住院或反復住院分離的重復菌株。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.3 PFGE 試驗 (1)挑取AB單菌落接種于營養平板，37 ℃孵育過夜，用比濁儀調整細菌懸液濃度，使濁度為3.80～4.20，加入1% Seakem Gold膠，混勻制備膠塊；(2)使用含蛋白酶K細胞裂解液(CLB)消化2 h，純水清洗膠塊2次，TE(10 mmol/L Tris:1 mmol/L EDTA，pH 8.00)清洗膠塊4次；(3)使用60 U ApaI(TAKARA公司)內切酶進行酶切，在37 ℃孵育4 h；(4)在CHEF-DRIII(Bio-Rad Laboratories公司)電泳儀中進行脈沖場電泳，電泳參數為5～20 s，19 h，電泳結束后，使用GelRed核酸染料染色，在凝膠成像儀中成像并保存。

1.4 PFGE分型標準 利用BioNumeric軟件對圖進行分析，圖譜條帶數量和大小相同為同一型別，3個條帶以下有差異為同一型別的不同亞型，4個條帶以上差異為不同型別。

2 結果

2.1 菌株來源 標本以痰為主(55份)，其余為血(4份)、支氣管肺泡灌洗液(簡稱灌洗液，2份)和腦脊液(1份)。患者中男女性別比為1.58∶1，年齡(56±14)歲，診斷為腦卒中(34例)、慢性阻塞性肺疾病(10例)、腦外傷(10例)、多發傷(5例)、腫瘤(2例)和冠心病(1例)。

2.2 藥敏結果 62株CRAB對頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、環丙沙星均耐藥，對氨基糖苷類的慶大霉素和妥布霉素的耐藥率較低，均為69.35%,對左氧氟沙星的耐藥率(25.81%)最低。見表1。

表1 62株CRAB的藥敏結果[株數(%)]Table 1 Antimicrobial susceptibility testing results of 62 strains of CRAB (No. of isolates[%])

2.3 PFGE結果 62株CRAB分為14個不同的型別，分別為A～N型，B、D、E、J和M型別僅包含1株菌，其中F型別包含5個亞型，A、G、H和K型別均有3個亞型，C和I型各有2個亞型。見圖1、表2。

M：標準菌株，1和6為I2亞型，2和5為F1亞型，3為H1亞型，4、10、11均為G1亞型，7為K2亞型，8為B型，9為G2亞型

圖1部分菌株PFGE電泳圖譜
Figure1PFGE electrophoresis map of partial strains

表2 62株CRAB的PFGE分型結果Table 2 PFGE typing results of 62 CRAB strains

2.4 流行病學關聯 對主要的克隆株臨床資料進行分析，32株菌(占51.61%)來自ICU，另有12株菌(占19.35%)的分離患者曾入住ICU。3株F2型菌株分離時間分別為2016年4月3日(首發菌株且來源于ICU)、4月10日和4月16日，分布在ICU、神經外科和呼吸內科，且來源于非ICU的菌株分離患者均曾入住過ICU。2015年8月15日—9月7日3株G1型菌株分別來自消化內科和ICU，且3位患者均在ICU住過，2016年8月10日—11月14日分離4株菌屬于G1型，首發病例在ICU入住，其余均來源于呼吸內科(其中1株分離的患者入住過ICU)。4株K3型菌株和3株L型菌株均來自ICU。見表3。

表3 主要CRAB克隆菌株的基本信息Table 3 Basic information of the main CRAB cloned strains

3 討論

菌株同源性分析常用的方法有多位點序列分析(MLST)、多位點可變數目串聯重復序列分析(MLVA)和PFGE等，其中PFGE以其重復性好、分辨力強被譽為細菌分子分型技術的“金標準”，在識別和追蹤感染暴發或流行中廣泛應用[17-18]。本研究菌株PFGE結果顯示，62株菌分為14個不同的型別，其中5個型別只包含1株菌，存在散發菌株，與多數研究[19-24](來自臨床的標本且未區分社區和醫院感染，較少提及散發菌株)結果不同，但仍有部分報道提示存在散發菌株，馬真[25]對138株AB進行同源性分析發現,24株散發菌株;周嬌嬌[26]在55株AB中發現3株散發菌株。本研究追蹤了B、D、E、J和M型菌株分離患者3個月內的住院史，5名患者都在不同級別的醫院住院，提示分離的AB多為外部帶入，與林家福[27]分子流行病學調查結果一致，四川北部地區有2所醫院存在相同基因型的CRAB。本研究調查的醫院為區縣級醫院，在分級診療的政策背景下作為大型綜合醫院和基層醫院的結合點，要接收下級醫院轉診的患者，同時也要接收上級醫院轉回的患者，導致散發菌株較多。AB已成為一個全球化的病原體并且在不斷進化[28]，雖存在外部輸入的可能，但14個PFGE型別中存在多個克隆菌株且分布于多個科室，提示醫院傳播仍是AB流行傳播的主要形式。3株F2亞型菌株分離間隔時間不超過1周，2例非ICU病例在入住ICU期間與首發ICU病例同在一個四人間進行治療；3株K3型中的2例患者分離時間僅間隔1 d且床位相鄰，另外1例患者的分離時間與首發病例相距近1個月，但其住院時間較長，與前2名患者均曾相鄰，故F2型和K3型發生醫院感染暴發可能性大。G1型菌株存在兩次疑似暴發，第1次疑似暴發首發病例為入住過ICU的消化內科CRAB血流感染患者，僅有1例ICU患者與消化內科患者在ICU的同一四人間相對的床位入住，另1例患者入住ICU時，其他患者已轉出ICU，且所在床位與消化內科患者并未在同一四人間；第2次疑似暴發首發病例為ICU病例，其余3例患者來自呼吸內科，其中1例呼吸內科患者入住過ICU且與首發病例在ICU有共同入住時間，但床位相距較遠，另2例呼吸內科患者均未入住ICU，住院時間也無交集，床位也不相鄰。L型3株分離間隔時間均超過1個月，住院時間無交叉，無床位聚集，不能確定為暴發。G1型和L型疑似暴發的病例并未全部在短時間內形成病例聚集，床單元聚集趨勢不明顯，CRAB醫院傳播明確，一部分亞型菌株形成暴發，另一部分亞型菌株長期存在于科室造成所住患者感染。所有暴發的首發病例均來自于ICU或者與ICU有關。存在潛在傳染源的科室應對物體表面進行徹底消毒，特別是醫務人員頻繁接觸的物體表面，如床欄桿、床旁桌、病床隔簾、門把手、護理站臺面、病歷夾、電話按鍵、電腦鍵盤、鼠標、呼吸機操作面板、監護儀面板、微量注射泵、輸液泵等。物體表面與AB流行和暴發有較強的關聯性[29-30]，在床位不緊張時實行輪換制度，對空置的病區進行消毒，經過監測合格后再重新開放。對于新發現的CRAB，一定要采取隔離措施。研究[31]表明，有效的消毒隔離措施對控制醫院流行和暴發有重要作用。醫務人員的手也可能成為AB的傳播媒介[32]，應加強手衛生，有效控制其醫院傳播。本研究屬于回顧性研究，無法對當時的環境或可疑物品進行采樣，不能對其更詳細的傳播途徑進行闡述，在今后研究中需要改進。

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