臨床分離金黃色葡萄球菌的耐藥特點(diǎn)和MRSA分子分型

賈 珉, 江元山, 朱建華, 高嘉嘉, 王永濤, 胡志敏, 劉志鋼

(1 武漢市第一醫(yī)院, 湖北 武漢 430022; 2 武漢市疾病預(yù)防控制中心, 湖北 武漢 430015)

唑的敏感率高于MSSA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。皮膚軟組織分離的MRSA對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、莫西沙星、利福平的敏感率為86.90%～95.24%，而痰分離的MRSA僅為1.56%～15.63%。967株金黃色葡萄球菌檢測(cè)出210株攜帶mecA基因，10株攜帶PVL基因，210株MRSA 中有8株未分型，占3.81%。MLST主要以ST 239(177株)為主；SCCmec分型主要以Ⅲ型(177株)為主；spa分型主要以t 030(177株)為主；agr分型主要以Ⅰ型(196株)為主。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是金黃色葡萄球菌獲得甲氧西林抗性基因mecA而形成的，是醫(yī)院感染常見病原菌之一，對(duì)臨床上使用的抗菌藥物常出現(xiàn)多重耐藥，其耐藥基因常位于mecA周圍，和mecA偶聯(lián)在一起，因而有學(xué)者將其命名為SCCmec，即葡萄球菌盒式染色體mec(staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)[1]。由于SCCmec結(jié)構(gòu)的不同導(dǎo)致不同型別的菌株耐藥性和流行特點(diǎn)均不同，而對(duì)于不同來源的MRSA，社區(qū)獲得性MRSA致病性較醫(yī)院獲得性MRSA強(qiáng)，且大部分?jǐn)y帶殺白細(xì)胞素基因(Panton-Valentine leukocidin gene，PVL)，該基因與各種皮膚感染和壞死性肺炎關(guān)系密切。本研究對(duì)MRSA進(jìn)行藥敏分析及基因分型，為了解MRSA的流行病學(xué)特點(diǎn)及預(yù)防MRSA傳播有重要意義。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 某院2014年1月—2015年11月所有住院患者檢出的金黃色葡萄球菌，剔除同一患者相同部位檢出的重復(fù)菌株。并將菌株來源標(biāo)本分為皮膚軟組織標(biāo)本、痰標(biāo)本和其他來源標(biāo)本；其他來源標(biāo)本包括血、尿、引流液(透析液、胸腔積液、腹腔積液、導(dǎo)管引流液和傷口膿液)。

1.2 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 金黃色葡萄球菌常規(guī)分離按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)進(jìn)行，金黃色葡萄球菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)分別應(yīng)用GP細(xì)菌鑒定卡和GP-67細(xì)菌藥敏卡在Vitek 2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)上進(jìn)行。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923、ATCC 29213；銅綠假單胞菌ATCC 27853和大腸埃希菌ATCC 25922。

1.3 細(xì)菌DNA模板制備 挑取MRSA臨床分離株轉(zhuǎn)入液體LB培養(yǎng)基中37℃搖床200 r/min振搖過夜培養(yǎng)，離心收集菌落，棄上清后加入TE緩沖液300 μL混懸，加入5 μL葡萄球菌溶菌酶消化細(xì)菌，37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，提取細(xì)菌DNA步驟按照TIANamp Bacteria DNA Kit操作說明稍加調(diào)整進(jìn)行，每個(gè)PCR反應(yīng)液中分別加入1.5 μL細(xì)菌DNA洗脫液做模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 MRSA分離株的多重PCR鑒定 采用Zhang K等[2]研究中引物對(duì)所收集MRSA進(jìn)行分子鑒定，確認(rèn)金黃色葡萄球菌并攜帶mecA抗性基因，繼而鑒定其為MRSA菌株，同時(shí)進(jìn)行PVL毒素基因檢測(cè)。

1.5 MRSA分離株的SCCmec分型 第一套方案采用多重PCR SCCmec分型。所用引物參考Milheiri?o C等[3]的研究，考慮到第一套實(shí)驗(yàn)方案中部分菌株帶型不易確定，故第二套方案采用Kondo Y等[4]研究中引物作進(jìn)一步證實(shí)，具體實(shí)驗(yàn)均根據(jù)文中條件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程中確保ccr位點(diǎn)/mec位點(diǎn)和J區(qū)兩個(gè)區(qū)域同時(shí)有預(yù)期PCR產(chǎn)物檢出。SCCmec Ⅳ型亞型鑒定參考Milheiri?o C等[3]研究中引物和條件進(jìn)行。為了有效區(qū)別不同電泳片段，第一套方案PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于2.0%瓊脂糖凝膠中100 V電泳75 min；第二套方案PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠中100 V電泳45 min。

1.6 金黃色葡萄球菌附屬因子調(diào)節(jié)子(agr)分型、金黃色葡萄球菌蛋白A基因(spa)分型和多位點(diǎn)序列分型(MLST) 根據(jù)參考文獻(xiàn)引物和PCR條件對(duì)MRSA菌株進(jìn)行agr分型分析。根據(jù)申恩華等[5]研究中PCR反應(yīng)對(duì)spaX區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，雙向測(cè)序后到網(wǎng)站(http://www.spaserver.ridom.de/)對(duì)每條序列進(jìn)行spa分型。根據(jù)Enright MC等[6]的研究，對(duì)7個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送英駿生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序；測(cè)序結(jié)果通過MLST數(shù)據(jù)庫(http://www.nlst.net)進(jìn)行MLST分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Whonet 5.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同標(biāo)本來源MRSA檢出情況 2014年1月—2015年11月共檢出非重復(fù)金黃色葡萄球菌967株。標(biāo)本來源分別為：皮膚軟組織710株，痰94株，其他標(biāo)本163株(血110株、尿16株、引流液37株)。MRSA檢出210株，MRSA總檢出率為21.72%；其中痰標(biāo)本MRSA檢出率最高，為68.09%，皮膚軟組織檢出率最低，為11.83%，痰和皮膚軟組織標(biāo)本中MRSA檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=185.23，P<0.01)。見表1。

表1 不同標(biāo)本來源的MRSA檢出情況(株)Table 1 Detection result of MRSA from different sources of specimens (Strain)

表2 金黃色葡萄球菌對(duì)常見抗菌藥物的敏感情況Table 2 Susceptibility of S. aureus to common antimicrobial agents

-：無相關(guān)數(shù)據(jù)

2.3 不同來源標(biāo)本MRSA的藥敏情況 共分離MRSA 210株，其中分離自皮膚軟組織84株、痰64株、其他標(biāo)本62株；皮膚軟組織分離MRSA對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、莫西沙星、利福平的敏感率為86.90%～95.24%，而痰分離MRSA僅為1.56%～15.63%；但皮膚軟組織分離MRSA對(duì)紅霉素和克林霉素的敏感率分別為15.48%、29.76%，而痰標(biāo)本分離MRSA分別為46.88%、68.75%。見表3。

2.4 MRSA分離株基因檢測(cè)與分型 967株金黃色葡萄球菌檢測(cè)出210株攜帶mecA基因，10株攜帶PVL基因。210株MRSA 中有8株未分型，占3.81%。MLST共有6種ST型，其中主要以ST 239(177株)、ST 59(12株)、ST 398(5株)、ST 5(5株)為主；SCCmec分型共有4型，主要以Ⅲ型(177株)、Ⅴ(10株)、Ⅳ(10株)為主；spa分型共有6型，主要以t 030(177株)、t 437(13株)、t 002(5株)、t 034(5株)為主；agr分型共有3型，其中以Ⅰ型(196株)、Ⅱ(5株)為主。見表4。

表3 不同來源標(biāo)本MRSA對(duì)常見抗菌藥物的敏感情況Table 3 Susceptibility of MRSA from different sources of specimens to common antimicrobial agents

表4 MRSA分離株MLST型別與SCCmec、spa、agr分型Table 4 MLST, SCCmec, spa, and agr typing of MRSA strains

3 討論

自1961年在英國發(fā)現(xiàn)世界首例耐甲氧西林菌株，進(jìn)而將金黃色葡萄球菌劃分為MSSA和MRSA以后，MRSA逐漸成為全世界醫(yī)院感染的主要病因。報(bào)道[7-8]顯示，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，介入治療、腹膜透析、靜脈留置導(dǎo)管等技術(shù)破壞了人體正常防御機(jī)制，MRSA臨床檢出有下降趨勢(shì)，取而代之的是耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)成為醫(yī)院感染的重要病原菌。在本地區(qū)引起醫(yī)院感染的葡萄球菌屬細(xì)菌中是否也出現(xiàn)這樣的趨勢(shì)，有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示967株金黃色葡萄球菌中檢出210株MRSA，檢出率為21.72%，同時(shí)該院臨床分離的73.42%金黃色葡萄球菌來源于皮膚軟組織，而大多數(shù)醫(yī)院金黃色葡萄球菌分離主要以呼吸道標(biāo)本為主，故應(yīng)根據(jù)臨床癥狀排除污染或定植，否則會(huì)高估MRSA檢出率。

從本研究的藥敏結(jié)果可看出，臨床所分離MRSA和MSSA均未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬古霉素、利奈唑胺耐藥株，MRSA對(duì)9種臨床常用抗菌藥物的敏感率均比MSSA低，且表現(xiàn)為多重耐藥，其中對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的敏感率最低，糖肽類最高，這可能與抗菌藥物的使用負(fù)荷和MRSA的多重耐藥機(jī)制有很大的關(guān)系。

臨床分離的MRSA進(jìn)行SCCmec分型是區(qū)分醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的一個(gè)重要指標(biāo)，醫(yī)院獲得性的MRSA菌株常常攜帶SCCmecⅠ～ Ⅲ型中的一種，而社區(qū)獲得性MRSA或非多重耐藥MRSA菌株攜帶SCCmecⅣ型或Ⅴ型[9-10]。由于兩者對(duì)抗菌藥物的敏感性及毒力存在差異，故檢測(cè)SCCmec分型及耐藥譜，可明確菌株分型特點(diǎn)及流行株，進(jìn)一步結(jié)合耐藥譜合理選用抗菌藥物，從而有效預(yù)防與控制耐藥菌株的傳播和感染。本研究 210株MRSA中檢出5株SCCmec Ⅱ型(2.38%)，177株SCCmec Ⅲ型(84.29%)；10株SCCmec Ⅳ型(4.76%)，10株SCCmec Ⅴ型(4.76%)；說明臨床分離的MRSA菌株中以醫(yī)院獲得性MRSA為主。

MLST和spa分型均是基于公共數(shù)據(jù)庫，對(duì)MRSA菌株特定靶基因的序列分型，有利于比較不同時(shí)間和空間的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)流行克隆菌株在分子分型上的宏觀變化趨勢(shì)[11-12]。本研究通過spa分型共檢出6種型別，其中以t 030型為主(84.29%)，表明t 030型是該MRSA主要流行的分子型別，這與全國性MRSA分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)論[13-14]相一致。MLST和spa分型顯示，ST239-MRSA-SCCmecⅢ-t030為優(yōu)勢(shì)型菌株(84.29%)，其次為ST59- MRSA-SCCmecⅤ-t437(3.33%)，ST59-MRSA-SCCmecⅣ-t437(2.38%)，ST398-MRSA-SCCmecⅣ-t034(2.38%)。與孫明姣等[15]研究發(fā)現(xiàn)中國大陸兒童CA-MRSA 分離株以ST59克隆為主一致，但分型不同，兒童最主要的流行型是ST59-MRSA-SCCmecⅣa-t437 型，其次為ST59-MRSA-SCCmecⅤ-t437 型，考慮可能成人與兒童年齡段不同，所以導(dǎo)致MRSA優(yōu)勢(shì)型不同，需要大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析。金黃色葡萄球菌的agr系統(tǒng)調(diào)控大約為100個(gè)基因的表達(dá)，包括毒素、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解途徑，根據(jù)agrD和agrC的多態(tài)性分為4個(gè)agr型的金黃色葡萄球菌。本研究中agr分型共檢出3型，主要以agrⅠ型為主(93.33%)，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道結(jié)果相一致。

PVL是由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的細(xì)胞外毒素，大多數(shù)社區(qū)感染性MRSA攜帶PVL基因，因此PVL陽性可以間接證實(shí)為社區(qū)獲得性感染[17]。PVL由兩種蛋白質(zhì)組成，即S和F蛋白(LukS-PV，LukF-PV)，兩種組分各有不同的生物活性和功能，對(duì)人體的多核白細(xì)胞(PMNs)和巨噬細(xì)胞具有高度的特異性，是一種致病性蛋白，與各種皮膚感染和嚴(yán)重的壞死性肺炎密切相關(guān)。目前5種主要的PVL 陽性CA-MRSA克隆菌株(ST1、ST8、ST30、ST59、ST80)已經(jīng)散布全世界[18]。本研究共發(fā)現(xiàn)PVL基因陽性菌株10株，占MRSA 4.76%，分型多為ST398-MRSA-SCCmecⅣ-t034，標(biāo)本主要來源于皮膚感染，與報(bào)道中PVL的型別分析相一致。ST398從遺傳背景獲得PVL，向社區(qū)中個(gè)體的傳播，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)療問題，因此，監(jiān)測(cè)和限制這一克隆的傳播尤為重要。

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