右歸丸對腎陽虛大鼠精子的作用

謝怡敏，姚歡

右歸丸最早載于張景岳先生的《景岳全書》[1]：大懷熟八兩;山藥炒四兩;山茱萸微炒三兩;鹿角膠炒珠四兩;菟絲子炙四兩;杜仲姜汁炒四兩;當歸三兩;肉桂二兩;制附子二兩。每嚼服二、三丸。以滾白湯送下,其效尤速。方中附子、肉桂、鹿角膠培補腎中之元陽,溫里祛寒,為君藥。熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥滋陰益腎,養肝補脾,填精補髓,取“陰中求陽”之義,為臣藥。正如張介賓所言:“善補陽者,必于陰中求陽,則陽得陰助,而生化無窮。”佐以菟絲子、杜仲補肝腎,健腰膝;當歸養血和血,與補腎之品相配,以補養精血。諸藥合用,肝脾腎陰陽兼顧,仍以溫腎陽為主,妙在陰中求陽,使元陽得以歸原,故名“右歸丸”。本方從腎氣丸中減去“三瀉”,而加入大隊補藥,這就使藥效專于溫補。同時,將腎氣丸中干地黃改為熟地黃,也使此方溫性大增,而不同于腎氣丸的平補。

本實驗擬以右歸丸治療腎陽虛大鼠，觀察其精子活動率改變及睪丸和附睪的重量、血液中睪酮的檢測，考察右歸丸對腎陽虛大鼠精子的作用。

1 材料與試劑

1.1 藥材

右歸丸基本藥物組成:熟地黃24 g、山藥12 g、山茱萸9 g,枸杞子9 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、杜仲12 g、肉桂6 g、當歸 9 g、制附子6 g、淫羊藿12 g、補骨脂12 g。藥材購于成都杏林藥房，打磨成粉劑，用雙蒸水溶解，根據中華人民共和國藥典，每公斤體重10.26 g灌胃給予實驗動物。

1.2 試劑

氫化可的松，天津金耀氨基酸有限公司，批號：1106021。

1.3 實驗動物

成年雄性SD大鼠，SPF級，體重約200 g，由四川成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK（川）2013-24。

2 方法

2.1 造模及分組

實驗動物的制備：隨機將動物分為正常對照組，腎陽虛組，腎陽虛右歸丸治療組三組，腎陽虛組（5只），大腿內側肌肉豐富處注射氫化可的松25 mg﹒(kg﹒d)-1,連續21天。正常對照組按2 mL﹒d-1，皮下注射生理鹽水，連續21天。腎陽虛右歸丸組模型組造模方法同腎陽虛組，第8天開始右歸丸組每天灌胃右歸丸，共14 d[2]。正常組和模型組以生理鹽水灌胃。

2.2 睪丸、附睪稱重及精子的獲取

斷脊髓法處死大鼠，迅速取睪丸和附睪，先用生理鹽水洗去粘附的毛發和血液等，濾紙吸干，雙側睪丸、附睪稱重。將一側附睪尾置于裝有培養液的EP管中，用小剪刀將附睪尾煎碎，放入37℃孵箱30 min后，制備精子懸液。

2.3 精子活動度檢測

將精液用Ham’s F-10培養液（Hyclone公司）稀釋后，調節密度至1×107個/mL，每份精子標本分為兩個標本，用計數器計算每類精子的數目，向血細胞計數板的每個計數槽加入10 μL的精子標本。按WHO方法檢測A級精子比率，B級精子比率[3]。

A 快速前向運動（37℃，速度≥25 um/s）；B慢速或呆滯的前向運動

C 非前向運動；D 不動

2.4 ELISA法測血清T的含量

各組大鼠心臟取血，待血液凝固后吸取血清，設置空白/標準和待測孔，標準孔加樣50uL,待測孔加入待測血清10 μL和樣品稀釋液40 μL，37℃孵育30 min，洗滌液洗滌5次，每孔加入50 μL酶標試劑，空白孔除外，37℃，30 min；洗滌5次，每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕混勻，37℃避光顯色10 min后，加入終止液50 μL，用酶標儀測定450 nm各孔的吸光度。繪制標準曲線，按照每組樣本的A450，查出各自的濃度。

2.5 統計學分析 利用軟件SPSS 21.0進行數據分析 各組間采用方差分析，P＜0.05認為有顯著差異。

3 結果

3.1 各組大鼠表現

空白組大鼠無異常，明顯較另外兩組大鼠狀態好，皮毛光澤，活躍好動，精神良好。腎陽虛組大鼠倦怠，運動減少，注射部位出現脫毛，食欲下降，體溫降低。腎陽虛加右歸丸組狀態居于未見明顯異常，但活動度不如空白組，較腎陽虛組要好。

3.2 各組大鼠睪丸、附睪重量比較

結果如表1所示，模型組和右歸丸組睪丸較正常組明顯減少，模型組和右歸丸組未見明顯改變。附睪重量正常組和右歸丸組明顯高于模型組。

表1 各組大鼠睪丸、附睪重量比較

3.3 精子活動度檢測

結果如表2所示，A、B級精子正常組和右歸丸組明顯高于模型組。

表2 各組大鼠A、B級精子比例

3.4 血清T水平檢測

結果如表3所示，血清T含量正常組和右歸丸組明顯高于模型組。

表3 各組大鼠血清T檢測

4 討論

目前世界上約6～8千萬對不育夫婦,占已婚夫婦的10%～15%左右,其中40%～50%為男性不育,且有逐年增多的趨勢。我國約有10%的夫婦患有不育癥,全國男性不育者約有5000萬人(2010年)。腎陽虛是造成男性不育的最重要原因。

腎為臟腑之本，十二經之根，與命門同一氣。腎陽對各臟腑有推動和溫煦作用，能提升臟腑之陽，如果腎陽不足，會引起很多臟器功能不足，如神疲乏力，精神萎靡，手腳冰冷，疲勞嗜睡，腰膝酸軟，神疲乏力，夜尿多，性功能減弱，陽痿早泄，舌淡苔白，脈弱等。腎陽虛證為中醫的基本證型之一，有研究發現右歸丸對腎陽虛的作用機制與現代醫學的下丘腦-垂體-性腺功能有關，還有研究發現腎氣丸、五子衍宗丸等對腎陽虛大鼠精子功能有明顯改善[4]，我們用右歸丸對腎陽虛大鼠的作用結果說明右歸丸對腎陽虛所致內分泌生殖功能紊亂也有明顯的改善。右歸丸是明代儒醫張介賓的名方。在張介賓的《景岳全書》卷51用于治療腎陽不足，命門火衰的常用方。現今多用于治療性功能減退、腎病綜合征及腰肌勞損等腎陽虛癥。方中附子、肉桂辛熱入腎,溫壯元陽；淫羊藿、補骨脂溫補腎陽。

睪酮主要由睪丸的間質細胞分泌，并能與FSH一起促進睪丸的曲細精管的發育及產生精子并維持附睪中精子的成熟，刺激并保持第二性征的出現。睪酮也是附睪、輸精管、精囊和前列腺等發育和成熟所必須的，睪酮進入前列腺后，經5a-還原酶的作用生成活性更強的雙氫睪酮，睪酮的分泌受下丘腦-垂體-性腺軸的調節[5]。

本研究采用右歸丸治療腎陽虛大鼠，可明顯增加腎陽虛大鼠的附睪重量、A級和B級精子比率級睪酮含量，說明右歸丸對腎陽虛大鼠的生殖內分泌有明顯治療作用。