四氯化碳致小鼠急性肝損傷模型造模要素及中醫藥防治的數據挖掘研究

胡鳳嬌，宋文杰，王張，梁源，劉光麗

肝病是威脅我國人民健康的重大疾病之一，具有發病率高、病程長、難以徹底治愈、病情反復發作的特點。肝病的對癥藥物治療是臨床上的常用手段，肝病種類很多，多會引起肝臟炎癥，致不同程度的肝損傷，因此肝損傷動物模型在肝病機理研究及藥物研發中非常重要。CCL4是常見的制作肝損傷動物模型的造模試劑，其成模率高、重復性好。因文獻報道的造模參數參差不齊，相差過大，導致模型的成功率差異很大，故本文對國內20多年來利用CCL4致小鼠肝損傷動物模型的造模要素及其中醫藥防治的實驗研究結果進行數據挖掘和分析，為提高造模效率及評價中醫藥防治肝損傷疾病的療效提供定量的方法學參考。

1 材料

在中國知識基礎設施工程(CNKI)、維普數據庫中，收集1990年-2016年期間（27年）研究CCL4致小鼠肝損傷動物模型的文獻，對文獻的完整程度、應用價值進行初步評價，最終納入393篇文章。

2 方法

2.1 信息錄入

應用Excel軟件，錄入文章題目，動物種別、體重、性別，四氯化碳所用稀釋液、濃度、給予量、給予部位、給予次數，造模與給藥先后關系，造模后處死間隔，受試藥物名稱、藥物組成、陽性藥，肝組織取材部位、肝組織病理描述，測試指標等信息。

2.2 數據庫構建

制作《CCL4致小鼠急性肝損傷的造模要素數據挖掘表》。

2.3 統計和分析

對錄入的每項數據進行統計和分析，定量歸納造模要素。

3 結果

3.1 動物

3.1.1 種別 多為KM小鼠，極少數使用ICR小鼠。

3.1.2 性別 主要為雄性。其原因可能是男性生活壓力較大，經常熬夜、酗酒、工作疲勞，且在動物實驗研究中，雄性鼠對黃曲霉毒素等致癌物更加敏感，更容易發生肝癌。

3.1.3 購進時體重 最常使用的體重為20±2 g（61.83%，意為納入文章中出現的頻率，后同），其次為22±2 g（4.58%）、19±1 g（3.82%）、22.5±2.5 g（3.56%）等。

3.2 造模

3.2.1 四氯化碳的稀釋液 常用者為花生油（41.73%）、橄欖油（18.58%）、豆油（7.13%）、植物油（5.85%）、色拉油（3.05%）、液體石蠟（2.80%）等。

3.2.2 四氯化碳的稀釋濃度 常見者為0.1%（35.62%）、0.2%（13.49%）、0.15%（7.12%）、1%（7.12%）、0.5%（6.87%）、0.08%（4.83%）、10%（4.07%）等。

3.2.3四氯化碳的給予體積 常見者為10 mg﹒kg-1（67.68%）、20 mg﹒kg-1（8.65%）、5 mg﹒kg-1（8.40%）、2 mg﹒kg-1（1.27%）等。

3.2.4 四氯化碳的給予劑量 常見者為0.01 mg﹒kg-1（27.74%）、0.02 mg﹒kg-1（15.52%）、0.05 mg﹒kg-1（8.14%）等。

3.2.5 四氯化碳給予部位 常見者為腹腔注射（84.73%）、灌胃（8.40%）、皮下注射（6.11%）。

3.2.6 四氯化碳給予次數 絕大多數文獻選擇一次性給予造模（95%）。

3.2.7 造模后動物處死時間 多在12～24 h之間，最常見者為24 h（30.28%）、16h（27.23%）、18h（9.16%）、20h（5.85%）、12h（5.09%）。因此階段處于肝損傷巔峰期，處死時間太短，肝損傷不完全；時間太長，已經造成的肝損傷開始修復。

3.3 評價指標

3.3.1 常見生化指標 詳見表1。造模成功后，血清中的ALT、AST、MDA、肝指數、TNF-α、ALP、NO、LDH、TG、TBIL、IL-6、TGF-β1、NF-κB、IL-1β均上升，SOD、GSH-PxGSH、CAT、ALB、T-AOC、TP、P450、Cytκ.b5、IL-10均下降。ALT、AST是肝臟功能的重要檢測指標，其變化與肝臟受損程度成正相關。

表1 指標及其變化趨勢

核因子 NF-κB ↑ 3 ↓ 3白介素-10 IL-10 ↓ 3 ↑ 3白介素-1β IL-1β ↑ 3 ↓ 3白介素-2 IL-2 ↑ 2 ↓ 2一氧化氮合酶 NOS ↑ 2 ↓ 2細胞色素 Cyt.b5 ↓ 2 ↑ 2肝糖原 —— ↑ 1 ↓ 1↓1↑1肝臟蛋白 —— ↓ 2 ↑ 2肝細胞生長因子 HGF ↓ 2 ↑ 2細胞間黏附分子 1ICAM-1/CD54↑2↓2谷胱甘肽還原酶 GR ↓ 2 ↑ 2總膽固醇 TC ↑ 2 ↓ 2膽堿酯酶 ChE ↓ 2 ↑ 2肝功能白球比例 (A/G) ↓ 2 ↑ 2 caspase-3 —— ↑ 2 ↓2谷氨酰轉肽酶 GGT ↑ 2 ↓ 2 β-半乳糖苷酶 β-Gal ↑ 1 ↓ 1硫代巴比妥酸反應產物 TBARS ↑ 1 ↓ 1膽紅素 BIL ↑ 1 ↓ 1肝藥酶 —— ↓ 1 ↑ 1游離脂肪酸 FFA ↑ 1 ↓ 1肝指酶 HL/HTGL↑ 1 ↓ 1球蛋白 GLB/G - 1 - 1山梨醇脫氫酶 SDH ↑ 1 ↓ 1血尿素氮 BUN ↑ 1 ↓ 1白介素-8 IL-8 ↑ 1 ↓ 1脂質過氧化物 LOOH ↑ 1 ↓ 1肝細胞人體抑癌基因 P53 ↑ 1 ↓ 1 Toll樣受體 TLR4 ↑ 1 ↓ 1直接膽紅素 DBIL ↑ 1 ↓ 1肝再生增強因子 ALR ↓ 1 ↑ 1羥脯氨酸 Hyp ↑ 1 ↓ 1 Bcl-2相關x蛋白 Bax ↑ 1 ↓ 1淋巴細胞瘤一2蛋白 Bel-2 ↓ 1 ↑ 1

3.3.2 其它不常見生化指標 詳見表1。IL-2、NOS、Cyt.b5、肝糖原、肝臟蛋白、HGF、CD54、GR、TC、ChE、A/G、caspase-3、GGT、β-Gal、TBARS、BIL、肝藥酶、FFA、HL/HTGL、GLB、SDH、BUN、IL-8、LOOH、P53、TLR4、DBIL、ALR、Hyp、Bax、Bel-2等。

3.3.3 肝組織變化

3.3.3.1肝組織取材部位 大多數取整肝，其余取材部位包括肝左葉、肝右葉、最大肝葉以及肝小葉。

3.3.3.2 肝組織外觀大體描述 正常組小鼠的肝臟結構正常，外觀呈紅褐色，質地軟而富有彈性，無變性，壞死等病理變化；模型組小鼠的肝臟常表現為質地較脆，顏色灰暗，表面粗糙有許多結節，肝臟明顯腫大，淤血，肝臟表面有點狀出血。

3.3.3.3 肝組織病理學 以肝細胞壞死以及炎性細胞浸潤最為常見，其它病變包括水樣病變、氣球樣病變、肝細胞結構紊亂、脂肪形變、肝細胞索排列紊亂、肝臟表面病變等。

3.4 藥物防治

3.4.1 給藥方案 平均為14天。給藥時間常見者有先給藥后造模（79.64%）、造模同時給藥（11.96%）、先造模后給藥（5.60%）、僅造模（2.04%）、先給藥后造模給藥再同時進行（0.25%）。

3.4.2 陽性對照藥 主要有聯苯雙酯（49.36%）、水飛薊素（7.89%）、甘利欣（2.80%）、維生素E（1.02%）、益肝靈片（1.02%）、馬洛替酯（0.51%）、谷胱甘肽（0.51%）、護肝片（0.51%）、肝泰樂（0.51%）、秋水仙堿片（0.25%）等。

3.4.3 中藥

3.4.3.1 復方制劑 包括梔子柏皮湯、降脂利肝方、復方丹參注射液、復方苦參沖劑、朝醫方、二門五味湯、八味獐牙菜散、柴芩清肝膠囊等。

3.4.3.2 中藥材 涉及96種中藥材（括號內為文章篇數），即黃芪（17）、甘草（16）、丹參（14）、茵陳（14）、柴胡（13）、黃芩（13）、五味子（10）、梔子（9）、白花蛇舌草（7）、決明子（7）、郁金（7）、大青葉（7）、白術（6）、靈芝（6）、炒白術（6）、虎杖（5）、三七（5）、黨參（4）、白芍（4）、澤瀉（3）、紫草（3）、金錢草（3）、大棗（3）、葛根（3）、山楂（3）、垂盆草（3）、龍膽（3）、鱉甲（3）、絞股藍（3）、胡黃連（2）、大黃（2）、黃柏（2）、小田基黃（2）、半枝蓮（2）、生姜（2）、木香（2）、何首烏（2）、山豆根（2）、雞血藤（2）、女貞子（2）、香附（2）、馬鞭草（2）、何首烏（2）、石見穿（2）、川芎（2）、赤芍（2）、石斛（2）、波棱瓜子（2）、麥冬（2）、茯苓（2）、焦山楂（2）、雞內金（1）、海金沙（1）、板蘭根（1）、清半夏（1）、麥芽（1）、陳皮（1）、防風（1）、八月扎（1）、云芩（1）、荷葉（1）、桃仁（1）、陸英（1）、牡丹皮（1）、小花清風藤（1）、仙靈脾（1）、貓爪草（1）、延胡索（1）、土茯苓 （1）、薤白（1）、蚤休（1）、車前草（1）、焦麥芽（1）、焦神曲（1）、法半夏（1）、烏梅（1）、紅參（1）、苦參堿（1）、太子參（1）、葉下珠（1）、刺梨汁粉（1）、六月雪（1）、雞骨草（1）、牛黃（1）、蒼術（1）、降香（1）、天門冬（1）、芍藥（1）、獐芽菜（1）、唐古特烏頭（1）、矮叢風毛菊（1）、短管兔兒草（1）、節裂角茴香（1）、小檗皮（1）、菊花（1）、桔梗（1）。

3.4.3.3 黃酮類 包括紫心甘薯總黃酮、玉郎傘黃酮、野菊花總黃酮、小葉黑柴胡莖葉總黃酮、相思藤總黃酮、忍冬葉總黃酮、馬鞭草總黃酮、雞血藤總黃酮、黃蜀葵花黃酮、黃芩莖葉總黃酮、紅景天總黃酮、葛根總黃酮、甘草類黃酮、杜仲總黃酮、大豆異黃酮、大豆異黃酮、穿破石總黃酮、白花蛇舌草黃酮、銀杏葉提取物等。

3.4.3.4 苷類 包括白首烏C21甾體酯苷、紫丁香苷、竹節參總皂苷、特女貞苷、羥基積雪草苷、木通皂苷D、毛蕊花苷固體脂質納米粒、芒果苷滴丸、羅漢果甜苷、京尼平甙、黃芩苷、黃苠總甙、鬼針聚炔苷、大豆皂苷、橙皮苷等。

3.4.3.5 多糖類 包括窯歸多糖、羊肚菌胞內多糖、仙人掌多糖、鐵棍山藥多糖、酸棗多糖、肉蓯蓉多糖、龍葵多糖、殼寡糖I和殼寡糖Ⅱ、蕨麻多糖、金頂側耳多糖、絞股藍多糖、姬松茸多糖、霍山石斛多糖、灰樹花多糖、黃芪多糖、花生粗多糖、歸芪多糖、大棗多糖、純化當歸多糖、北五味子粗多糖、蚌肉多糖等。

3.4.4 有效性評價指標 詳見表1。給藥后，血清及肝臟中的ALT、AST、MDA、肝指數、TNF-α、ALP、NO、LDH、TG、TBIL、IL-6、TGF-β1、NF-κB、IL-1β均上升。給藥組小鼠的肝臟損傷（外觀和鏡下）程度均有不同程度的減輕，且存在劑量依賴性。

4 討論

研究表明，肝損傷的基本要素為細胞死亡。細胞死亡又分為壞死和凋亡。細胞壞死是細胞生物膜系統的完整性被破壞，導致胞質液的酶類釋出（如：ALT、AST），激起炎癥反應，炎癥細胞、細胞因子、毒性氧基團的出現會進一步損傷鄰近組織。細胞凋亡則不會引起炎癥反應，但可以激活轉化生長因子β，促進纖維化，凋亡的本質雖為機體保證正常細胞轉換的生理過程，但凋亡過多或過少均可造成病理現象。壞死和凋亡的共同之處在于線粒體結構的改變，失去功能。線粒體功能衰竭形成壞死；線粒體釋放出一些凋亡誘發因子造成凋亡。外來毒素或有害因子劑量較低時，以凋亡為主，劑量較高時，以壞死為主。但不十分絕對，在考慮治療方案時，應同時采取防止和阻斷壞死與凋亡雙管齊下的方針。

而本文未將小鼠肝組織病變程度與給予劑量進行相關性分析，若結合分析，預計可通過控制四氯化碳的給予劑量進而控制肝臟的損傷病變程度，真正達到定量造模的要求。