冬蟲夏草人工菌絲體體外抗腫瘤試驗研究

孟亞鵬，陶宏凱，曾佑琴

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計每年球每年死于癌癥患者高達(dá)700萬，其死于胃癌患者占了70萬例，我國胃癌患病率和死亡率是世界平均水平2倍多。胃癌初期無明顯癥狀，至發(fā)現(xiàn)經(jīng)常處于中晚期，現(xiàn)有的放、化療手段難以根本解決問題。利用傳統(tǒng)的中醫(yī)藥尋找治療胃癌的新藥和手段是目前的一個熱點[1]。

冬蟲夏草是一種復(fù)合物，由冬蟲夏草菌寄生于蟲草蝙蝠蛾的子座及幼蟲尸體上形成，中醫(yī)認(rèn)為冬蟲夏草味甘、性溫暖、益腰腎、止咳痛、補虛損、益精氣。目前的研究也顯示冬蟲夏草具有抑制腫瘤、促調(diào)節(jié)免疫等作用。天然蟲草生長海拔較高，周期長，產(chǎn)量小，因此價格昂貴。從冬蟲夏草菌種分離培養(yǎng)的蟲草菌，可以看做冬蟲夏草的代替品，化學(xué)成分分析表明，蟲草菌中的蟲草酸、蟲草多糖，其活性與天然冬蟲夏草無明顯差別[2]。因此利用蟲草菌絲體代替天然的冬蟲夏草，并進行體外抗腫瘤研究，意在明確冬蟲夏草人工菌絲體對腫瘤的作用效果和藥理機制，為冬蟲夏草人工菌絲體資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人工菌絲體購至浙江萬豐企業(yè)集團制藥有限公司發(fā)酵蟲草菌粉，供試胃癌細(xì)胞為人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，試驗藥品、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、胰酶與EDTA消化液、MTT等；試驗儀器有超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、分光光度計、培養(yǎng)板等。

1.2 方法

1.2.1 冬蟲夏草人工菌絲水提物的方法 采用自動煎藥機講購買的蟲草菌粉制成水煎液，調(diào)整水煎液的pH 到7.3～7.4，然后采用32層紗布過濾，15000 r﹒min-1離心20 min，上述操作重復(fù)一次，吸取上清，采用過濾除菌的方法收集過濾液，4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 冬蟲夏草人工菌絲水提物的處理 獲取的冬蟲夏草人工菌絲水提物設(shè)置3個質(zhì)量濃度組(10、100、1000 μg﹒mL-1)，用環(huán)磷酰胺設(shè)置陽性，用無菌蒸餾水配置成0.5 μg﹒mL-1溶液，過濾除菌。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基添加1 5%的胎牛血清和1%雙抗。消化呈單個細(xì)胞采用0.25%的胰酶和0.02%EDTA(1∶1)，細(xì)胞消化后進過稀釋然后進行計數(shù)，以103、104個細(xì)胞進行接種培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)胞增殖活性的檢測 SGC-7901細(xì)胞增殖活性檢測采用MTT法，利用MTT檢測細(xì)胞增殖的抑制率。加入冬蟲夏草人工菌絲水提物的細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，棄培養(yǎng)基，加入MTT進行顯色。利用分光光度計測定570 nm的吸光率。細(xì)胞數(shù)量以光密度值（OD）來表示，OD值越高，表示細(xì)胞增殖活性越強。抑制率=(對照組OD值-給藥組OD值)/對照組OD值*100%[3～4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬蟲夏草人工菌絲水提物對SGC-7901細(xì)胞生對長的影響

表1 冬蟲夏草人工菌絲水提物對SGC-7901細(xì)胞生長的抑制作用

從表1可以看出，冬蟲夏草人工菌絲水提物對SGC-7901細(xì)胞的抑制效果較好，冬蟲夏草人工菌絲水提物10、100、1000 μg﹒mL-1三個劑量組和環(huán)磷酰胺組處理的OD值均明顯低于對照組，冬蟲夏草人工菌絲水提物對SGC-7901細(xì)胞的抑制率和冬蟲夏草人工菌絲水提物的量有關(guān)，加入冬蟲夏草人工菌絲水提物量越大抑制的效果隨之加強，此結(jié)果顯示冬蟲夏草人工菌絲水提物對SGC-7901細(xì)胞的毒性呈劑量依賴關(guān)系。且冬蟲夏草人工菌絲水提物1000 μg﹒mL-1和環(huán)磷酰胺組對SGC-7901細(xì)胞抑制率均達(dá)到75%以上，效果較好。

3 結(jié)論與討論

冬蟲夏朝中的有效成分主要是多種蛋白質(zhì)，抗真菌抗生素和真菌多糖，研究表明這些物質(zhì)對腹水瘤有明確的抑制作用。冬蟲夏草中的真菌多糖、蟲草酸對人體免疫系統(tǒng)有促進作用，可以提高骨髓細(xì)胞的造血功能，促進紅細(xì)胞的產(chǎn)生，對抗白血病和粒細(xì)胞的減少，也能抑制癌細(xì)胞的分裂，防止癌細(xì)胞擴散，增強巨噬細(xì)胞吞噬能力[5～6]。對青海產(chǎn)天然冬蟲夏草（特級）、四川產(chǎn)天然冬蟲夏草 (二級)、蟲草頭孢菌絲粉和蟲草菌絲浸膏進行了的成分分析表明，四個樣品中氨基酸的種類都是17種，其中谷氨酸含量最高，胱氨酸含量最低，四種樣品人體必需氨基酸含量一樣豐富，總氨基酸含量稍有差異外，氨基酸屬性基本一致，說明冬蟲夏草人工菌絲體與冬蟲夏草的成分基本一致，研究冬蟲夏草菌絲體可以解決冬蟲夏草數(shù)量少、價格昂貴的的問題。

本研究用冬蟲夏草人工菌絲體水提物對SGC-7901細(xì)胞進行了體外試驗，采用了MTT法檢測了藥物作用對SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草人工菌絲體水提物對SGC-7901細(xì)胞抑制效果較好，尤其在冬蟲夏草人工菌絲體水提物在高劑量1000 μg﹒mL-1時，抑制的效率可以到到76.48%。由此推論，冬蟲夏草人工菌絲體水提物抑制癌細(xì)胞的可能機制是通過提高機體免疫能力而間接影響癌細(xì)胞，而不是直接作用于癌細(xì)胞將其殺死，只是抑制了細(xì)胞的增殖[7]，后期的實驗需要在瘤株動物中進行后續(xù)的研究，為冬蟲夏草人工菌絲體的開發(fā)和利用提供依據(jù)。