基于Plackett-Burnman設計和Box-Behnken效應面法優化南寶戒毒清膠囊提取工藝

管志美，彭艷梅，王銀，王興國，彭宇，李躍輝*

南寶戒毒清膠囊系由湖南省中醫藥研究院和邵陽市中醫解毒研究所聯合研發的新型毒品戒斷藥，自2010年以來，臨床應用于毒品戒毒2500多例，療效確切。產品處方是由黃芪、遠志、黨參、人參、柏子仁等二十一味中藥組成的臨床經驗方，具有扶正固本，補氣安神，解痙止痛，鎮驚熄風之功效，臨床適用于因吸食阿片類毒品或甲基苯丙胺類毒品有戒斷癥狀綜合癥狀者。本文擬采用Plackett-Burnman設計聯合Box-Behnken效應面法對南寶戒毒清膠囊提取工藝進行優化，為后期產品的大生產及臨床應用研究提供可行性依據。

1 儀器與試藥

Agilent-1260高效液相色譜儀（ELSD-UM4800型蒸發光散射檢測器）；島津LC-20AT高效液相色譜儀（SPD-20A檢測器，LC-20A泵，LC-20B泵）；色譜柱（依利特Hypersil ODS2 ，4.6mm×250mm，5μm）；HD-200型高速多功能粉碎機（諸暨市海道機械有限公司）；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋、101-2AB型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；AL204電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司），YP5102電子天平（上海光正醫療儀器有限公司）。

黃芪、遠志等藥材均購于湖南省自然堂中藥飲片有限公司，經湖南省中醫藥研究院中藥研究所鑒定室鑒定，均符合《中國藥典》2015年版一部各藥材項下相關規定；乙腈、甲醇（一級色譜純Honeywell Burdick & Jackson）；水為重蒸餾水；黃芪甲苷對照品、細葉遠志皂苷對照品（批號：110781-201717、111849-201705，均由中國食品藥品檢定研究院提供）；其他試劑均為分析純。

2 試驗方法及結果

2.1 浸膏得率的測定[1]

按處方比例稱取黃芪、遠志等藥材共93.6 g，加水提取，濾過，合并濾液，減壓濃縮至一定體積。精密量取濃縮液適量，置己干燥至恒重的蒸發皿中蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱重，計算浸膏得率。

2.2 黃芪甲苷的含量測定[2～3]

2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水為流動相，梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速為0.8 mL﹒min-1，柱溫：25 ℃；蒸發光散射檢測器檢測，蒸發溫度100 ℃，霧化溫度95 ℃，氣體流速為2.8 L﹒min-1，增益值為1.0。理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于4000。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液的配制 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.49 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取濃縮液適量蒸干，加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂（內徑為1.5 cm，柱高為12 cm），以水50mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 測定 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照“2.2.1”項下色譜條件測定。

2.3 細葉遠志皂苷的含量測定[4～5]

2.3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.05%磷酸溶液(72：28為流動相，流速為1mL﹒min-1，柱溫：25 ℃；檢測波長為210 nm。理論板數按細葉遠志皂苷峰計算應不低于3000。

2.3.2 對照品溶液的配制 取細葉遠志皂苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.42 mg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取濃縮液適量蒸干，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，置圓底燒瓶中，蒸干，殘渣加10%氫氧化鈉溶液50 mL，加熱回流2 h，放冷，用鹽酸調節pH值為4～5，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次50 mL，合并正丁醇液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 測定 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照“2.3.1”項下色譜條件測定。

2. 4 Plackett-Burnman試驗設計篩選主要影響因素

2.4.1 因素及水平[6]在實際大生產中，影響提取工藝的因素包括藥材粒度、提取次數、浸泡時間、提取時間、提取溶劑及溶劑用量等，本課題在前期的初步研究中采用了水提，確定了溶劑種類。故現以黃芪甲苷提取量（mg）和細葉遠志皂苷提取量（mg）作為考察指標，運用Design-Expert8.0.5.軟件進行Plackett-Burnman設計，對藥材粒度、提取次數、浸泡時間、溶劑用量、提取時間進行考察。根據前期試驗結果設每個因素高低2水平，用1、-1表示。因素水平見表2，試驗設計及結果見表3。

表2 Plackett-Burnman設計因素水平表

表3 Plackett-Burnman設計試驗安排及結果

2.4.2 模型的建立及分析 運用Design-Expert8.0.5.軟件對表3中數據進行擬合、回歸分析和F檢驗，結果見表4。

表4 Plackett-Burnman設計模型方差分析

由表4可知，模型顯著；X2/提取次數、X4/溶劑用量、X5/提取時間對黃芪甲苷和細葉遠志皂苷的提取量影響均顯著；各顯著性影響因素大小順序為X4/溶劑用量＞X5/提取時間＞X2/提取次數，其他兩個因素包括藥材粒度、浸泡時間顯著性不明顯，故選擇溶劑用量、提取時間和提取次數作為Box-Behnken效應面法中的考察因素。

2. 5 Box-Behnken效應面法優選提取工藝[7～8]

2. 5. 1 設計方案與試驗結果 因為提取次數不是連續變量，故在本試驗中，提取時間設為總提取時間、溶劑用量則為溶劑總用量，結合Plackett-Burnman試驗設計篩選出的因素，選取提取次數、提取總時間和溶劑總用量3個因素為考察因素，分別以A、B、C表示，每個自變量的低中高水平分別以-1、0、1進行編碼，自變量及水平見表5。以黃芪甲苷提取量、細葉遠志皂苷和干膏率為評價指標，采用軟件Design-Expert8. 0. 5中的Box-Behnken試驗設計優選最佳提取工藝參數。方案及試驗結果見表6。

表5 自變量及水平

表6 Box-Behnken試驗設計及結果

2. 5. 2 數據處理及模型的擬合 多指標數據處理常采用總評“歸一值”（OD）法，對取值越小越好的指標di=(ymax-yi)/(ymax-ymin)，對取值越大越好的指標di=(yiymin)/(ymax-ymin)，OD=（d1d2d3……dn）1/n，i=1，2，3…，n，n為指標數。運用Design-Expert8.0.5.軟件，以OD值為響應值對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合，對OD值進行方差分析，結果見表7。

表7 Box-Behnken試驗設計的方差分析

A2 1 0.042 0.042 4.11 0.0824 B2 1 0.089 0.089 8.76 0.0211 C2 1 9.563E-003 9.563E-003 0.94 0.3643殘差 7 0.071 0.010失擬檢驗 3 0.051 0.017 3.29 0.1402純誤差 4 0.021 5.132E-003總誤差 16 1.42

利用Design-Expert8. 0. 5軟件對表5數據進行多元回歸擬合，得OD值對提取次數(A)、提取總時間(B)及溶劑總用量(C)的二次多項回歸模型：OD=0.60+0.10A+0. 090B+0. 36C－0. 041AB－0.048AC－0.002375BC－0.100A2－0. 15B2+0.048C2，（r= 0.9500），模型具有顯著性（P=0.0009＜0.05），失擬項不顯著（P=0.1402＞0.05），表明模型擬合度較高，回歸方程誤差較小。

2.5.3 效應面分析及Box-Behnken試驗模型預 根據回歸方程分析結果，運用Design-Expert8. 0. 5軟件，固定3個自變量中的任意一個繪制其他2個自變量對響應值（OD值）影響的等高線圖和三維曲面。見圖1-3。

圖1 提取次數和提取總時間對OD值影響的等高線和響應面圖（左等高線，右響應面）

圖2 提取次數和溶劑總倍數對OD值影響的等高線和響應面圖（左等高線，右響應面）

圖4 提取總時間和溶劑總倍數對OD值影響的等高線和響應面圖（左等高線，右響應面）

2.5.4 南寶戒毒清膠囊提取工藝參數的預測及驗證利用Design-Expert8. 0. 5軟件根據擬合的效應面及等高線圖，結合二次回歸模型，預測南寶戒毒膠囊的最佳提取工藝參數為提前次數為2.22次，提取時間為3.77小時，溶劑總倍數為22.00倍，OD值為1.02483。考慮到大生產的可操作性，將工藝優化為：加水提取2次，第一次加水12倍，提取2小時；第二次加水10倍，提取1.5小時。

稱取南寶戒毒清膠囊1000粒的處方量藥材，按優化后的工藝參數提取，并進行浸膏得率和黃芪甲苷、細葉遠志皂苷提取量的測定，平行試驗3次，結果見表7。

表7 驗證試驗結果

試驗結果表明測定的OD值與理論OD值相近，RSD%為0.73%，表明模型的預測性較好且該提取工藝重復性較好。

3 討論

中藥及其復方中提取工藝的優劣直接關系到臨床療效。常見的提取工藝優化包括單因素試驗、正交試驗等，這些方法往往存在試驗組數量少，精密度不佳等問題，導致試驗結果準確性不高、可靠性低，已不太實用。因此尋找更好、更可靠、更有效的試驗研究方法成為當下的關鍵。Plackett-Burnman是一種主要針對因子數較多，且未確定眾因子相對于響應變量的顯著性而采用的篩選試驗設計方法，通過比較各因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性，從而達到篩選的目的，避免后期優化試驗中由于因子數太多或部分因子不顯著而浪費試驗資源[9]。Box-Behnken效應面法是一種因素與響應值之間顯非線性關系的試驗設計方法，不使用點而采用多元線性和二次項模型擬合，從而保證所有的因素落在一個均勻地水平，能較好地體現依賴變量與非依賴變量之間的關系，利用軟件的擬合可以對回歸方程的分析尋求最佳工藝參數[10]。本文通過Plackett-Burnman設計結合Box-Behnken效應面法優選出了南寶戒毒清膠囊的最佳提取工藝，經驗證與預測值接近，證明所選的提取方法合理、可行。