中獸藥芪藍口服液水提工藝的響應面法優化

張晨，陳哲杰，甘帥，李杰，江茂源，馬美伶，何瑤

畜禽感染性疾病高發，濫用抗生素類藥物產生嚴重后果，面對抗生素耐藥性及畜禽產品中的殘留問題，農業部已將硫酸粘桿菌素等4種飼料用抗生素列入禁用目錄。以改善現狀為目標，結合當下畜牧業市場現狀，禁止濫用抗生素，發展綠色畜牧業已經成為不可逆轉的主流趨勢。中草藥飼料添加劑因具有促進生長、抗菌抑菌、改善肉品質、有害殘留低等特點，符合綠色畜牧業的發展趨勢，受到生產廠家和研發機構的重視。中草藥防治抗病毒常以“清熱解毒、扶正祛邪”為治療原則，以清熱解毒類中草藥配伍具有增強機體免疫功能的中藥。中獸醫師經長期臨床總結了芪藍口服液處方，芪藍口服液由黃芪、板藍根兩味中藥組成，藥理研究表明黃芪、板藍根具有調節免疫力、抗炎、抗病毒等[1～2]作用，臨床研究證實黃芪與板藍根配伍在體外對豬繁殖與呼吸綜合征病毒有很好抑制作用[3～4]。目前該方臨床應用多為煎煮成湯劑使用，具有制備工藝混亂，質量穩定性差，安全性與有效性難以保障的缺點。

為提高芪藍口服液提取工藝的科學性與合理性，保證藥物質量穩定性，提高臨床療效，本研究采用原水提工藝，擬對水提工藝進行優化。試驗選取《中國獸藥典》2015版對黃芪、板藍根規定的黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春三個指標成分的含量，同時考慮提取液的干膏收率，作為綜合評分指標，在此基礎上運用Box-Behnken中心設計原理結合響應面分析法對中獸藥芪藍口服液的水提工藝進行優化，從而保證芪藍口服液提取工藝的科學性與合理性，為芪藍口服液的進一步研究奠定基礎。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

黃芪甲苷對照品（批號：160329）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號：160329）、（R, S）告依春對照品（批號：160422），均購于成都普斯生物科技有限公司。甲醇和乙腈為色譜純（美國，Sigma-Aldrich公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。黃芪飲片（批號：1501003）；板藍根飲片（批號：1503003），均購于新荷花中藥飲片股份有限公司，經鑒定符合《中國獸藥典》2015版標準。

1.2 儀器

Agilent1200型高效液相色譜儀（美國，安捷倫公司）；C18色譜柱（Global公司，4.6 mm ×250 mm×5 μm）；METTLER電子分析天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-501旋轉蒸發儀（上海耀特儀器股份有限公司）。

2 試驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1 “芪藍”水提樣品的制備 稱取黃芪飲片70 g，板藍根飲片30 g，平行稱取需求份數，依試驗設計方案規定，分別加水（補加飲片吸水量），煎煮，合并煎煮液并濾過，以旋蒸儀濃縮至250 mL，即得水提樣品，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品液10 mL置于20mL容量瓶中，加入甲醇定容，將定容后的溶液超聲處理30 min，再移取5 mL，以12000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配成每1 mL含黃芪甲苷0.514 mg的準備液；分別取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品和（R, S）告依春對照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容，配成每1 mL含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.497 mg，含（R, S）告依春0.101 mg的準備液。

2.2 色譜條件

2.2.1 黃芪甲苷 進樣量20 μL；檢測波長為203 nm；柱溫:25 ℃；乙腈-0.1%磷酸水（33∶67）洗脫，流速為1.0 mL/min[5]。

2.2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、(R, S)告依春 進樣量10 μL；檢測波長：245 nm；柱溫：25 ℃；流動相：A：0.1%磷酸水，B：乙腈；流速：1 mL/min，洗脫梯度：0～20 min，9%乙腈；20～22 min，9%～20%乙腈；22～55 min，20%～40%乙腈[6]。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 取黃芪甲苷對照品溶液0.25、0.5、1、2、4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；混合對照品溶液0.25、0.5、1、2、4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。分別將兩種不同濃度的對照品溶液按“2.2.1”“2.2.2”項下條件由低到高分別進樣，測定峰面積。以進樣質量濃度（mg/mL）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程。

表1 三種指標成分的線性關系

2.3.2 精密度試驗 分別按照“2.2.1”、“2.2.2”項下要求，每次取同一混合對照品溶液，分別連續進樣6次，測定峰面積。結果黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的RSD分別為 2.76% 、1.92%、1.45%。

2.3.3 重復性試驗 取同一“芪藍”水提樣品按“供試品溶液的制備”項下方法平行制備6份， 相同六份供試品溶液分別按照“2.2.1”“2.2.2”項下要求分別測定峰面積。黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的RSD分別為2.29%、1.90%、1.42%。

2.3.4 加樣回收試驗 精密量取欲測成分含量已知的“芪藍”水提樣品溶液5 mL，平行量取6份，3份加入“2.1.3”項下的黃芪甲苷對照品溶液適量，3份加入“2.1.3”項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷和（R, S）告依春的混合對照品溶液適量，全部照“供試品溶液的制備”項下方法制備，并分別按照“2.2.1”“2.2.2”項下要求分別測定峰面積測定并計算回收率。黃芪甲苷的平均回收率為101.29%，RSD值為2.48%；毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為99.98%，RSD值為1.22%；（R, S）告依春的平均回收率為99.92%，RSD值為1.58%。

2.4 樣品指標成分含量測定

取按“2.1.2”項下規定制得的待測樣品溶液適量加入進樣瓶，分別將儀器設定為“2.2.1”“2.2.2”項下規定的色譜條件進行指標成分峰面積測定，并分別根據標準曲線計算指標成分含量。

2.5 干膏率測定

精密量取各試驗組的水提樣品液50 mL，分別置于干燥至恒定重量的蒸發皿中，于水浴鍋上105 ℃水浴蒸干至恒定重量，置干燥器中冷卻至室溫，后迅速精密稱取重量，并計算干膏收率。

2.6 單因素試驗及響應面法試驗中芪藍口服液水提參數的綜合評分方法

綜合評分（Y）滿分為100分，根據方中用藥量及君臣關系，劃分黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春、及干膏收率的權重分別為30、30、25、15。在此基礎上得到加權綜合評分公式：Y=Y1/Y1Max×30+Y2/Y2Max×30+Y3/Y3Max×25+Y4/Y4Max×15，其中Y1為每個試驗樣品重復取樣3次測得黃芪甲苷質量濃度和的平均值，Y1Max為樣品中黃芪甲苷質量濃度的最大值；Y2是每個試驗樣品重復取樣3次測得的毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量濃度平均值，Y2Max為樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量濃度的最大值；Y3為每個試驗樣品重復取樣3次測得的（R, S）告依春質量濃度平均值，Y3Max為樣品中（R, S）告依春質量濃度的最大值；Y4為每個試驗樣品重復取樣3次測得的干膏率，Y4Max為樣品中干膏率最大值。

2.7 水提工藝的單因素試驗及結果

2.7.1 單因素試驗 通過單因素試驗，在其他提取條件不變的情況下，分別考察提取時間、料液比、提取次數對黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的含量及干膏收率對綜合評分的影響。

表2 單因素試驗設計水平

2.7.2 單因素試驗結果

提取時間對綜合評分的影響 單因素試驗分別考察了煎煮0.5、1、1.5、2、2.5、3 h對指標成分及干膏收率的影響，結果（見圖1）表明，按照“綜合評分方法”隨著煎煮時間的延長，綜合評分逐漸升高，0.5～1.5 h最為明顯，其后趨于平穩，為兼顧提取效果與能源節約，本試驗將提取時間控制在1.5～2.5 h內。

提取次數對綜合評分的影響 單因素試驗分別考察了提取1、2、3、4、5次對指標成分及藥效作用的影響，結果（見圖1）表明，按照“綜合評分方法”隨著提取次數的增加，獲得的綜合評分逐漸升高，提取1～3次綜合評分上升明顯，3次以后評分提高不明顯。考慮到節約能源與縮短提取時間，最后確定提取次數控制在1～3次范圍內。

料液比對綜合評分的影響 單因素試驗分別考察了料液比為1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12對指標成分及藥效作用的影響，結果（見圖1）表明，按照“綜合評分辦法”隨著加水量的增加，獲得的綜合評分逐漸升高，料液比為1:7～1:9時評分上升明顯，料液比大于1:9以后評分變化趨于穩定。綜合考慮后確定料液比應控制在1:9～1:11范圍內。

圖1 煎煮時間、煎煮次數、料液比多芪藍口服液提取工藝評分的影響

2.8 水取工藝的響應面法優化試驗及結果分析

2.8.1 響應面法試驗 根據Box-Behnken中心組合設計原理，參考單因素試驗結果，選取提取時間（A）1.5、2、2.5 h；提取次數（B）1、2、3次；料液比（C）1:9、1:10、1:11作為考察對象，以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的含量及干膏收率的綜合評分為響應值，采用Design Expert8.0.6統計分析軟件的響應面分析法設計試驗，研究其對芪藍口服液提取的影響，以得到芪藍口服液的最佳水提工藝。本試驗采用3因素3水平的響應面法試驗進行設計見表4，響應面法試驗方案及結果見表5。2.8.2 數學回歸分析 運用統計軟件Design Expert 8.0.6對表5中各試驗組綜合評分進行多元回歸擬合，得綜合評分對自變量A、B、C的二次多元回歸方程為Y=90.85+1.66A+12.04B+0.20C-2.02AB-0.32AC-0.33BC-0.69A2-3.43B2-1.35C2，所建立的二次多項式模型具有高度的顯著性（P＜0.0001），模型決定系數R2= 0.9819，表明模型擬合度良好，方差分析及回歸系數顯著性檢驗結果見表6。

表4 Box-Behnken中心組合設計因素水平

表5 響應面法試驗方案及結果

表6 數學回歸分析結果

利用Design-Expert 8.0.6軟件，根據擬合模型繪制不同影響因素對綜合評分的三維曲線圖與等高線圖，（見圖2、3）。由圖2、3結合表6中A、B、C三個因素的F值大小可得三個因素對綜合評分的影響大小為B＞A＞C。提示，在本試驗各因素的考察范圍內優選提取工藝，因素A與因素B對評分影響較大，應首先考慮提高因素B（提取次數）的水平，其次是提高因素A（提取時間）的水平，而因素C(料液比)對綜合評分影響最小，料液比應適當控制，以避免實際生產中對提取液的濃縮環節耗費更多能源，增加生產成本。

圖2 各因素交互作用對綜合評分影響的三維效應面圖

圖3 各因素交互作用對綜合評分影響的等高線圖

在響應面模型的基礎上，利用Design-Expert 8.0.6軟件對提取工藝參數的二次回歸方程求解，得水提工藝：提取時間（A）為1.5 h，提取次數（B）為3次，料液比（C）為1∶9.84。參考擬合模型數學回歸分析中三個因素對綜合評分影響的分析結果，為節約實際生產成本與實際操作方便將二次回歸方程求解工藝參數加以修正，得最優工藝：提取時間（A）為1.5 h，提取次數（B）為3次，料液比（C）為1∶9。

2.9 提取工藝驗證試驗

按照處方量稱取藥材，平行稱取5份，運用Box-Behnken響應面試驗所得的最佳水提工藝進行藥材的提取，驗證試驗結果見表7。試驗結果與模擬值基本接近，各試驗組與理論值相對誤差均小于0.97%，表明模型預測值與真實值間擬合度良好，同時5組試驗綜合評分的RSD值為0.62%，表明所采取水提工藝具有較好的穩定性，進一步印證了該工藝的可靠性。

表7 提取工藝驗證試驗結果

3 結論

本研究根據芪藍口服液處方的藥材比例及君臣關系分別將黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、（R,S）告依春及干膏收率的綜合評分權重設為30、30、25、15，使得綜合評分更加合理，能較為合理的體現提取工藝對藥材提取效果的影響，在此基礎上利用Box-Behnken響應面法在中藥復方研究中的優勢，初步得出水提工藝，并根據實際生產需要對工藝進一步優化，最后確定出芪藍口服液的最佳提取工藝為：取處方量藥材，提取3次，每次加9倍量水，一次1.5小時。所得最佳工藝簡便可行、結果穩定。

目前，對黃芪、板藍根及其復方的提取工藝研究中，正交試驗是采用較多的方法。本文采用Box-Behnken響應面法優化中獸藥芪藍口服液的水提工藝，避免了正交設計、均勻設計等方法的不足，使試驗所得的最佳水提工藝更具科學性，為芪藍口服液的進一步研究奠定了基礎。