六神曲發酵前制備工藝研究

張紅玲，覃藝，孫佳彬，范潤勇，黃勤挽 ，孫繼林，姚仁川

六神曲又名六曲、神曲，最早收載于《藥性論》：“化水谷宿食、結積滯，健脾暖胃”。六神曲以面粉麥麩為發酵基質，加入苦杏仁、赤小豆，以青蒿、辣廖、蒼耳草煎煮的汁液混勻后發酵而成。主治功效為健脾和胃，消食調中。用于脾胃虛弱，飲食停滯，胸痞腹脹，小兒食積，臨床應用廣泛。作為一種傳統的復方曲劑，其物質基礎和作用機制并不十分明確，目前藥典尚未收載該品種。雖然有一些地方標準收載六神曲，但是各地發酵工藝、炮制工藝存在較大差異，且并沒有統一的質量標準[1]。目前關于六神曲發酵工藝研究較多，而且工藝的統一初具模型，然而在發酵前原藥材的處理上尚沒有明確的規定，也沒有相關研究，本實驗以此為依據，進行了一系列的探索，以期為六神曲的發酵工藝控制和質量標準統一提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

藥材：苦杏仁、赤小豆、青蒿、辣廖、蒼耳草，上述飲片均由四川輔正藥業有限責任公司提供。

試劑試藥：蘆丁對照品（批號151023）、槲皮素對照品（批號150302）、綠原酸對照品（批號140601），均由成都普菲德生物技術有限公司提供；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、乙醇等有機試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

FW135 型中草藥粉碎機( 上海隆拓儀器設備有限公司)、UV-6100型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）、ZDHW型電熱套（北京中興偉業儀器有限公司）、FA1204C型萬分之一電子天平（上海越平科學儀器有限公司）、DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海將任實驗設備有限公司）、HHS-8S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）、RE-2000B型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 苦杏仁赤小豆粉碎工藝研究

按照六神曲標準，需將苦杏仁、赤小豆粉碎成粗粉。《中國藥典》對于粗粉的定義為：全部通過二號篩但混有通過四號篩不超過40%的粉末，故粉碎中過粗或者過細均不適合。

2.1.1 實驗方法 采用單因素試驗法，對苦杏仁、赤小豆采用單獨粉碎和混合粉碎的方法進行考察，以粉碎成恰當合格率為指標，設計試驗如下：

（1）取苦杏仁、赤小豆各100g，置杯式粉碎機中，分別粉碎1min、2min、3min……直至粉末合格率達標。

（2）取苦杏仁、赤小豆各50g，混合，置杯式粉碎機中，粉碎1min、2min、3min……直至粉末合格率達標。

2.1.2 實驗結果結果見表1。

表1 苦杏仁、赤小豆粉碎工藝研究

從表1可見，單獨粉碎時，苦杏仁較難粉碎過篩，所需時間長且回收率較低；而赤小豆較易粉碎，但是容易細粉過多，不符合粗粉要求。混合粉碎時，不至于過快粉碎導致細粉過多，較好控制粉碎程度，且粉末收得率高。在高速杯式粉碎機中，每100g樣品（苦杏仁、赤小豆各50g混合均勻），粉碎1min即可。工業大生產中，一般采用萬能粉碎機，將苦杏仁、赤小豆適量，等分混合均勻，采用2號篩網，粉碎通過即可。

2.2 辣蓼、青蒿、蒼耳草煎煮工藝研究

2.2.1 煎煮工藝設計 正交試驗以出膏率及成分提取率為指標，影響因素有加水量、浸泡時間、煎煮時間、煎煮次數等，設計4因素3水平的正交試驗。按照六神曲標準的要求，制法中已經規定了煎煮時間為1小時，煎煮次數為1次，故不再作為篩選考察指標。取青蒿、辣廖、蒼耳草各約33.3g(合計100g），混合均勻，因素水平表見2。

2.2.2 含量測定 （1）對照品溶液的制備精密稱取槲皮素（綠原酸1mg）對照品10mg，用95%乙醇溶解并定容到10mL，超聲充分溶解即得1mg/mL的槲皮素(綠原酸)對照品溶液，備用。

（2）供試品溶液的制備取0.5mL原煎煮藥液，加無水乙醇定容到10mL，搖勻后超聲10min，過濾，取濾液作為供試品溶液備用。

（3）標準曲線的制定分別吸取對照品溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5mL于6個25mL容量瓶中，用95%乙醇定容到25mL；以加入0mL對照品的溶液作為空白溶液，在370nm處測定吸光度，并以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標作標準曲線，得回歸方程。

（4）含量測定以加入0mL對照品的溶液作為空白溶液，直接將供試品溶液在370nm處測定吸光度，計算各供試品槲皮素、綠原酸含量。

原藥液中槲皮素含量=所測得槲皮素含量*1000mL/0.5mL

原藥液中綠原酸含量=所測得綠原酸含量*1000mL/0.5mL

2.2.3 干膏率測定 精密量取25mL上述煎煮藥液，置于已恒重的蒸發皿中，水浴加熱揮干，于105℃烘箱干燥至恒重,稱定重量，計算出膏率，每組平行2份，計算平均值。

干膏率=(干膏重*1000mL/25mL)/原藥材重100g*100%

2.2.4 評價指標 以槲皮素、綠原酸的含量以及干膏率進行綜合評分為指標。權重系數分配為：出膏率（權重20%）、槲皮素含量（權重40%）、綠原酸含量（權重40%）。正交試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

2.2.5 試驗結果 從表3可知，以綜合評分為考察指標時，A3＞A2＞A1，B2＞B1＞B3，C和D為定值。從表4可知，4個因素中，因素B（浸泡時間）對煎煮整體評分有顯著影響。因此辣蓼、青蒿、蒼耳草的最佳煎汁工藝組成為A3B2，而C、D因素為定值，即加入12倍水量，浸泡30min，加熱至沸騰后煎煮1h，煎煮一次。

表2 L9(34)因素水平表

表3 L9(34)正交實驗結果

表4 方差分析結果

2.3 濃縮工藝研究

2.3.1實驗方法 按部頒六神曲標準規定，取六神曲發酵其他固體成分處方量，逐漸加入提取藥液，每次加入100mL，直至制成符合“揉之成團，觸之即散”標準的軟材。確定符合條件所需藥液的范圍。

2.3.2 試驗結果 濃縮終點的判斷見表5。

從表10可見，在藥液500～800mL范圍內，制備的軟材情況較好。故標準處方量下制備軟材所需液體量范圍為500～800mL。按12倍加水量記（不考慮藥材吸附和煎煮損失），藥液需濃縮33.3%～58.3%。

3 結論與討論

六神曲作為傳統發酵類中藥，發酵時各種條件變化都會影響其成品質量。然而目前六神曲并沒有統一的質量標準，不同地區標準中，其生產工藝也存在較大差異。本實驗針對六神曲制備，對其發酵前期工作進行標準量化統一，以期規范六神曲生產工藝。提高市場上六神曲產品質量，保證其藥效。

《衛生部藥品標準中藥成方制劑第十九冊》六神曲標準規定：原料藥七味，苦杏仁、赤小豆粉碎成粗粉，與面粉、麥麩混勻，另取辣蓼、青蒿、蒼耳草加水煎煮1小時，濾過，濾液濃縮成清膏，趁熱與上述藥粉拌勻。

現優化工藝為以上七味，苦杏仁、赤小豆混合，過2號篩粉碎成粗粉，與面粉、麥麩混勻，另取辣蓼、青蒿、蒼耳草加12倍量水，浸泡30分鐘，煎煮1小時，用200目濾布板框濾過，濾液濃縮成清膏（原生藥6.5倍量水），趁熱與上述藥粉拌勻。