缺氧預(yù)處理對缺血性腦卒中大鼠的腦保護作用及H3R17me2表達的影響

楊 鵬, 吳世政, 侯 倩, 陳曉娟

在我國，腦卒中的年齡標(biāo)準(zhǔn)化患病率、發(fā)病率及死亡率分別為1114.8/10萬人、246.8/10萬人/年和114.8/10萬人/年，其中缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)的發(fā)病者及患病者分別占69.6%和77.85%[1]。目前，IS的主要治療措施是6 h以內(nèi)的動靜脈溶栓及血管內(nèi)介入。盡管取得了明顯的治療效果，但是對于發(fā)病超過其治療時間窗的患者，這些措施的治療效果明顯下降，出血風(fēng)險明顯增高。缺氧預(yù)處理(hypoxic precondition，HPC)是指低氧刺激后，機體對隨后嚴(yán)重的缺氧/缺血性損傷耐受性增強的現(xiàn)象，但其具體機制尚未完全闡明。近些年來，自噬在腦缺血損傷中的作用得到越來越多關(guān)注，H3R17me2是AMPK-SKP2-CARM1自噬信號軸的關(guān)鍵蛋白，它表達量的多少提示著該信號通路的激活程度。本實驗通過大鼠間歇性低壓缺氧預(yù)處理及大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型的制備，觀察大鼠的神經(jīng)損傷及H3R17me2蛋白的表達變化，探討缺氧預(yù)處理對缺血性腦卒中大鼠的腦保護作用及H3R17me2在其中扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 實驗相關(guān)試劑及儀器設(shè)備

1.1.1 實驗主要試劑 大鼠用MCAO線栓(2432-5，北京西農(nóng)科技有限公司)；Nissol stain，焦油紫法(G1430，購自北京索萊寶科技有限公司)；UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒(KIT-9710，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)；DAB顯色試劑盒(DAB-0031，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)；高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(R0010，北京索萊寶科技有限公司)；PierceTMBCA Protein Assay(貨號：23225，Thermo Fisher scientific)；Anti-Histone H3(asymmetric di methyl R17)抗體(ab194707，abcam)；alpha tubulin Mouse Monoclonal 抗體(66031-1-Ig，Proteintech)。

1.1.2 實驗儀器設(shè)備 青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心低壓氧艙；超速離心機(Eppendorf AG 22331Hamburg，德國)；Bio-RAD xMark 10235(日本)；Amersham Imager 600發(fā)光顯像分析儀(日本)。

1.2 動物來源及分組 實驗用純系SPF級SD雄性大鼠，體重180～220 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號：No.61001700001958。隨機分為正常對照(normal control，NC)組、假手術(shù)(sham operated control，SC)組、單純?nèi)毖躅A(yù)處理(hypoxic precondition，HPC)組、單純梗死組(middle cerebral artery occlusion，M)組、缺氧預(yù)處理后梗死組(middle cerebral artery occlusion after hypoxic preconditioning，HM)組，每組12只大鼠。

1.3 缺氧預(yù)處理 將實驗大鼠置于模擬海拔5000 m的低壓氧艙，每天2 h，連續(xù)5 d。大鼠氧艙內(nèi)放置期間不予飼料、飲水，出艙后正常飼養(yǎng)。

1.4 大鼠局灶缺血病理模型制備 參考Longa 法，加以改良。大鼠禁食12 h，10%水合氯醛氯化鈉溶液(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，備皮、固定大鼠，碘伏消毒術(shù)野皮膚，手術(shù)剪頸部正中開一約1 cm小口，鈍性分離皮下筋膜、肌肉等組織。暴露左側(cè)頸總動脈以后，分離左頸總動脈及迷走神經(jīng)，結(jié)扎左頸總動脈近心端，遠(yuǎn)心端留線備用。頸總動脈分叉處動脈夾夾閉該側(cè)頸總動脈，在其稍近心端用顯微剪剪一斜口，插入線栓，松開動脈夾，以適當(dāng)角度將線栓插入該側(cè)頸內(nèi)動脈，從勁總動脈分叉處算起，進線栓深度16～18 mm時，可有輕微阻力感，提示插線栓成功，固定線栓，縫合皮膚及皮下組織，再次碘伏消毒。術(shù)后置于37 ℃恒溫箱維持大鼠正常體溫。

1.5 神經(jīng)功能缺損評價 大鼠術(shù)后24 h行Longa 5級評分。0分：活動自如，無神經(jīng)功能缺損癥狀功大鼠；4分：意識喪失，昏迷狀態(tài)。剔除評分為0分、4分者，余者入組行后續(xù)操作。

1.6 腦組織形態(tài)學(xué)染色

1.6.1 冰凍切片 大鼠10%水合氯醛麻醉后，開胸，去除心包，暴露心臟，從心尖部進針，經(jīng)左心室插入升主動脈，血管鉗鉗夾固定針頭，打開輸液器開關(guān)，待右心耳充盈后，剪開右心耳。0.9%氯化鈉溶液內(nèi)灌注， 直至左心耳開口處流出清亮液體后換成4%多聚甲醛PBS緩沖液(pH=7.4)灌注內(nèi)固定。待大鼠尾部僵硬強直后，斷頭取腦，放置于4%多聚甲醛PBS緩沖液(pH=7.4)外固定。18 h后，序貫梯度蔗糖4%多聚甲醛脫水固定。常規(guī)冰凍切片，厚20 μm，4 ℃，保存于PBS緩沖液中。

1.6.2 尼氏染色 常規(guī)貼片，通風(fēng)櫥內(nèi)晾片48 h，以蒸餾水體積/冰乙酸體積=1/1萬的冰乙酸水溶液配成濃度0.001 g/ml的焦油紫染液，2000 r/min離心10 min，去除沉淀顆粒備用。切片在氯仿、無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇各浸泡1 min，蒸餾水浸泡數(shù)秒，焦油紫37 ℃恒溫、室溫下各孵育15 min，蒸餾水洗滌2 min，95%酒精乙酸溶液分色，無水乙醇每次浸泡3 min，重復(fù)3次，二甲苯透明5 min，重復(fù)3次，中性樹膠封片。晾干后，光鏡下觀察，梗死側(cè)皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)拍照。

1.6.3 免疫組織化學(xué)染色 采用冰凍切片漂片的SP法，具體步驟：(1)選取含有典型海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)的腦片置于盛有PBS緩沖液(pH=7.4)的24孔板中洗滌3次，每次5 min；(2)吸凈殘余液體后，加入適量內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫下平搖30 min；(3)PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min；(4)吸凈殘余液體，加入適量正常非免疫動物血清，室溫平搖孵育1 h；(5)吸凈殘余液體，加入適量5% BSA稀釋的一抗H3R17me2(1/300)，4 ℃平遙50 r/min過夜；(6)室溫復(fù)溫2 h；(7)PBS緩沖液洗滌6次，每次5 min；(8)吸凈殘余液體，加入適量生物素標(biāo)記的第二抗體室溫平遙50 r/min孵育1 h；(9)PBS緩沖液150 r/min洗滌6次，每次5 min；(10)吸凈殘余液體，加入適量鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫平遙50 r/min孵育30 min；(11)吸凈殘余液體，加入適量DAB顯色液，顯微鏡下控制染色深度；(12)貼片，通風(fēng)櫥晾干；(13)梯度酒精脫水，二甲苯透明化，中性樹膠封片；(14)光鏡下觀察，梗死側(cè)皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)拍照；(15)采用評分法半定量分析：按照染色深淺，將染色神經(jīng)細(xì)胞分為弱陽性、中等陽性、強陽性，分別記弱陽性=1分、中等陽性=2分、強陽性=3分，每張照片評分=(弱陽性細(xì)胞數(shù)×1+中等陽性細(xì)胞數(shù)×2+強陽性細(xì)胞數(shù)×3)/該照片細(xì)胞總數(shù)。

1.7 大鼠腦組織蛋白提取 大鼠麻醉后斷頭取腦，取梗死側(cè)皮質(zhì)腦組織適量。剪碎后，以每10 mg組織加入100 μl 100/L濃度的高效 RIPA/PMSF 裂解緩沖液，超聲破碎儀冰浴下打碎腦組織，直至樣品中無粘稠狀物懸浮。4 ℃下，12000 r/min離心10 min。BCA法蛋白定量，加入蛋白上樣緩沖液煮沸10 min，分裝、-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 免疫印跡檢測H3R17me2的表達 (1)每孔上樣15 μg，行SDS-PAGE凝膠電泳，積層膠濃度5%，分離膠濃度10%;(2)電泳后切取目的條帶膠段，恒流下200 mA轉(zhuǎn)膜50 min，將目的蛋白H3R17me2、內(nèi)參蛋白β-actin 轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;(3)新鮮配制的5% BSA封閉液室溫封閉2 h后，加入封閉液稀釋的目的蛋白H3R17me2(1/1000)、內(nèi)參蛋白β-actin(1/8000)4 ℃，50 r/min平遙孵育過夜;(4)TBST(pH=7.4)洗滌PVDF膜7次，每次7 min后，分別加入相應(yīng)二抗(山羊抗兔IgG 1/10000，山羊抗小鼠IgG 1/10000)室溫50 r/min平遙孵育2 h;(5)TBST洗膜7次，每次10 min后，強效ECL發(fā)光液曝光，保存實驗結(jié)果圖片;(6)采用Image J軟件對實驗結(jié)果條帶進行半定量分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 MCAO組與HM組大鼠Z-Longa神經(jīng)功能缺失評分比較 MCAO造模手術(shù)后18 h行Z-Longa神經(jīng)功能缺失評分。結(jié)果顯示HM組大鼠評分明顯小于MCAO組(P﹤0.05)。

2.2 各組大鼠皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)尼氏染色 大腦皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)尼氏染色結(jié)果顯示：NC組、SC組、HP組神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)量及尼氏小體數(shù)量幾無差別；與前者相比，HM組腦缺血區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，形態(tài)欠完整，可見少量細(xì)胞碎片，尼氏小體數(shù)量減少，染色變淺；與HM組相比，MCAO組幾無完整神經(jīng)元，神經(jīng)元呈碎片化，尼氏小體明顯減少，染色模糊不清(見圖1)。

2.3 各組大鼠皮質(zhì)及海馬CA1區(qū) H3R17me2免疫組化染色 免疫組化染色顯示各組H3R17me2

評分?jǐn)?shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(皮質(zhì)：F=337.279,P<0.01；海馬CA1區(qū)：F=256.159,P<0.01)。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)NC組與SC組染色評分未見明顯差異(P>0.05),HP組、MCAO組、HM組與NC組相比，染色評分均增高(P<0.05)，MCAO組較HM組染色評分高(P<0.05),HM組較HP組染色評分高(P<0.05)。提示缺氧預(yù)處理可以上調(diào)H3R17me2的表達，但是腦梗死處理上調(diào)效力要高于單純?nèi)毖躅A(yù)處理，而缺氧預(yù)處理后腦梗死的上調(diào)效力介于兩者之間(見圖2、見表1)。

2.4 各組大鼠左側(cè)腦組織H3R17me2 的Western blot檢測結(jié)果比較 Westernb blot 結(jié)果顯示各組 H3R17me2灰度值與β-actin 灰度值比值數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=310.771,P<0.01)。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)NC組與SC組灰度值比值未見明顯差異(P<0.05),HP組、MCPO組、HM組與NC組相比灰度值比值均增高(P<0.05)，HP組較MCAO組增高更明顯(P<0.05)，HM組較HP組增高(P<0.05)，HM組較MCAO組增高(P<0.05)。提示缺氧預(yù)處理可以上調(diào) H3R17me2的表達，表現(xiàn)為缺氧預(yù)處理對H3R17me2上調(diào)效力大于腦梗死的上調(diào)效力。但是由于Western blot 結(jié)果未考慮存活細(xì)胞數(shù)量對蛋白定量結(jié)果的影響，導(dǎo)致與免疫組化結(jié)果的不同(見圖3)。

表1 各組大鼠H3R17me2免疫組化染色評分

皮質(zhì)評分：與NC組相比aP<0.05;與HP組相比bP<0.05;與M組相比cP<0.05;海馬評分：與NC組相比dP<0.0;與HP組相比eP<0.05;與M組相比fP<0.05

圖1 各組大鼠尼氏染色

圖2 各組大鼠H3R17me2免疫組化染色

圖3 各組大鼠腦組織Western blot的H3R17me2蛋白表達

3 討 論

本研究運用低壓氧艙模擬了海拔5000米高原地區(qū)間斷的缺氧預(yù)處理,驗證了HPC對成年大鼠局灶性腦缺血的神經(jīng)保護作用及其可能作用機制。(1)HPC可逆轉(zhuǎn)MCAO手術(shù)對大鼠皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)的神經(jīng)功能及組織形態(tài)上的損傷;(2)HPC可以下調(diào)MCAO手術(shù)后皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)H3R17me2蛋白的表達。

HPC被認(rèn)為是一種亞致死性的低氧暴露介導(dǎo)的可以減少隨后的嚴(yán)重缺血帶來的損傷的內(nèi)源性腦保護作用。在細(xì)胞、組織、動物、臨床層面都觀察到了HPC的這種神經(jīng)保護作用[2～4]。研究表明，腦缺血后自噬系統(tǒng)被激活[5～9]。有研究發(fā)現(xiàn)在短暫性全腦缺血(transient global cerebral ischemia，tGCI)后海馬CA1區(qū)自噬體及增多和LC3-Ⅱ蛋白上調(diào)，但在缺氧預(yù)處理后這種趨勢卻被逆轉(zhuǎn)[10]。AMPK-SKP2-CARM1信號軸能調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，同時CARM1依賴的精氨酸甲基化及H3R17me2蛋白的形成是自噬過程中的一個關(guān)鍵細(xì)胞核事件[11]。在營養(yǎng)饑餓的情況下，AMPK-SKP2-CARM1信號軸被激活，導(dǎo)致H3R17me2蛋白的表達上調(diào)，從而使一些自噬/溶酶體基因表達上調(diào)[11]。

我們通過在體的動物實驗，從分子及組織細(xì)胞學(xué)層面，運用低壓氧艙模擬高原低氧環(huán)境對MCAO手術(shù)后大鼠短期間斷低壓缺氧預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)高原HPC對局灶性缺血大鼠確有神經(jīng)保護作用。同時發(fā)現(xiàn)AMPK-SKP2-CARM1信號軸可能參與了HPC對MCAO手術(shù)后大鼠的神經(jīng)保護作用，提示運用該通路的阻斷劑如ellagic acid[12]，可能模擬HPC對該通路的阻斷作用，從而產(chǎn)生相似的神經(jīng)保護作用。為臨床藥物的研發(fā)提供一些啟發(fā)。

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