載脂蛋白E對脾臟淋巴細胞基質金屬蛋白酶-9表達的影響

范麗君, 盧文玉, 唐玉蘭, 黃 帆, 李一鋒, 盧珍梅, 韋俊杰, 鄭明華

中樞神經系統炎癥性脫髓鞘疾病如多發性硬化(multiple sclerosis,MS)等疾病的致病機制之一是血腦屏障(blood brain barrier,BBB)完整性受到破壞,在其動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)中已證實是由CD4+T淋巴細胞透過BBB滲入中樞神經系統(central nervous system,CNS)實質介導的自身免疫性炎癥反應所致[1]。

載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)在CNS炎癥相關疾病過程中參與BBB通透性的調節,ApoE基因敲除小鼠CNS炎癥因子增加且與BBB通透性改變有關。我們已發現,ApoE的缺乏會上調炎癥因子的表達,ApoE擬肽可以抑制該效應,從而減少BBB的破壞[2]。而淋巴細胞分泌的TNF-α等炎癥因子可以調控基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表達[3],進而影響BBB滲透性。因此,我們推測,ApoE可能影響外周淋巴細胞等免疫細胞的炎癥因子的分泌,并調節MMP-9的表達,最終影響BBB滲透性。目前諸多研究均集中在動物實驗中進行,在體外細胞層面的相關研究少有報道。

已證實EAE小鼠外周免疫激活先于中樞的病理學改變[4],因此,我們通過免疫原啟動小鼠外周免疫過程,在體外單獨研究ApoE對脾臟淋巴細胞分泌炎癥因子及MMP-9的影響,這也更好的排除了神經膠質細胞發揮的中樞固有免疫炎癥作用的干擾,以便更深入了解ApoE在CNS炎癥相關疾病中對BBB影響的病理機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡雌性C57BL/6J小鼠,體重17～20 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司[動物許可證號SCXK(京)2009-0004],飼養于廣西醫科大學實驗動物中心的SPF級動物房。

1.1.2 實驗試劑 MOG35- 55(序列MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)購于上海生工生物工程有限公司,純度>95%。百日咳毒素(PTX)和完全弗氏佐劑(CFA)購于美國Sigma公司；熱滅活結核菌素(H37Ra)購于美國BD公司；小鼠TNF-α、IL-17、MMP-9、基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。胎牛血清、RPMI-1640培養基、青霉素/鏈霉素(雙抗)購自美國Gibco公司；D-Hanks液購自武漢博士德生物公司；臺盼藍、紅細胞裂解液購自索萊寶科技公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫誘導 用0.01 mol/L的PBS緩沖溶液將少突膠質細胞糖蛋白(MOG35- 55)稀釋至2 mg/ml,與等量的含4 mg/ml熱滅活結核菌素(H37Ra)的完全弗氏佐劑充分混勻,在冰上使用全玻璃注射器抽打制備油包水乳劑抗原。在小鼠背部皮下多點注射MOG35-55乳劑抗原(0.2 ml/只)。免疫當天、免疫后48 h給每只小鼠腹腔各注射一次百日咳毒素200 ng。

1.2.2 脾臟淋巴細胞分離培養(參考Ping Kuang[5]等方法)及干預 免疫后第7天頸椎脫臼法處死小鼠,75%酒精消毒后,無菌條件下分別取ApoE-/-小鼠及WT小鼠脾臟,充分剔除筋膜及脂肪組織,予以無菌D-Hanks清洗兩遍,超凈臺內置于200目篩網,用5 ml注射器針芯輕輕均勻研磨,用適量無菌D-Hanks沖洗過濾,取濾液至15 ml離心管,1000 rpm/min離心5 min洗滌兩次,去上清,加入紅細胞裂解液(10 ml/只)于冰上裂解10 min除去紅細胞,1000 rpm/min離心5 min洗滌兩次,去上清,加入含胎牛血清和雙抗的RPMI-1640完全培養基輕輕均勻吹打制備細胞懸液接種于T25培養瓶,于5%CO2、37 ℃培養箱凈置24 h,以除去貼壁的巨噬細胞,收集未貼壁的細胞懸液即得到脾臟淋巴細胞。用臺盼藍染色,活細胞數大于95%后調整密度為1×106/ml備用。隨機分為4組,即ApoE-/- 實驗組(E-ApoE-/-)、WT實驗組(E-WT)、ApoE-/-對照組(C-ApoE-/-)、WT對照組(C-WT)。兩實驗組(E-ApoE-/-、E-WT)給予濃度為25 μg/ml的MOG35-55刺激淋巴細胞,兩對照組(C-ApoE-/-、C-WT)細胞給予等量生理鹽水作為對照處理,24 h后離心收集上清液。

1.2.3 炎癥因子及基質金屬蛋白酶檢測 取各組細胞上一步中收集的上清液各100 μl微升分別加入到TNF-α、IL-17、MMP-9、TIMP-1 ELISA試劑盒,測定各組淋巴細胞TNF-α、IL-17、MMP-9、TIMP-1的濃度,分析各組的表達差異。

2 結 果

2.1 各組脾臟淋巴細胞TNF-α、IL-17表達情況比較 與C-WT組比較,C-ApoE-/-組淋巴細胞TNF-α、IL-17的濃度升高,差異有統計學意義(P<0.05)；分別與對照組相比,E-ApoE-/-組和E-WT組淋巴細胞TNF-α、IL-17濃度均明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)；與E-WT組相比,E-ApoE-/-組TNF-α、IL-17的濃度明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)(見圖1A、B)。

2.2 各組脾臟淋巴細胞MMP-9表達情況比較 C-ApoE-/-組淋巴細胞MMP-9的濃度較C-WT組的濃度升高,差異有統計學意義(P<0.05)；E-ApoE-/-組和E-WT組淋巴細胞MMP-9濃度分別與對照組相比,其濃度均明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)；與E-WT組相比,E-ApoE-/-組MMP-9濃度明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)(見圖2)。

2.3 各組脾臟淋巴細胞TIMP-1表達情況比較 經兩兩比較,各組小鼠淋巴細胞TIMP-1濃度未見明顯差異,差異無統計學意義(P>0.05)(見圖3)。

ApoE-/-：載脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；TNF-α：腫瘤壞死因子-alpha；IL-17：白細胞介素-17

與E-WT組相比*P<0.05；與C-ApoE-/-組相比!P<0.05；與C-WT組相比#P<0.05

圖1 各組脾臟淋巴細胞培養液TNF-α(圖1A)、IL-17(圖1B)濃度的比較

ApoE-/-：載脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；MMP-9：matrix metalloproteinase-9

與E-WT組相比*P<0.05；與C-ApoE-/-組相比!P<0.05；與C-WT組相比#P<0.05

圖2 各組脾臟淋巴細胞培養液MMP-9濃度的比較

ApoE-/-：載脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；TIMP-1：tissueinhibitor of metalloproteinases 1

E-ApoE-/-組、E-WT組、C-ApoE-/-組、C-WT組脾臟淋巴細胞分泌TIMP-1的濃度未見明顯改變(P>0.05)

圖3 各組脾臟淋巴細胞培養液TIMP-1濃度的比較

3 討 論

ApoE是CNS中主要的載脂蛋白,在中樞內具有轉運脂質、神經營養、調節炎癥、調節免疫等多重生物學作用。動物研究已證實ApoE可以保護EAE小鼠的血腦屏障[6,7]。本研究發現,免疫誘導小鼠后,ApoE-/-小鼠和WT小鼠脾臟淋巴細胞均能分泌炎癥因子TNF-α、IL-17；體外用MOG35-55刺激脾臟淋巴細胞后,E-ApoE-/-和E-WT組淋巴細胞炎癥因子濃度均升高,且E-ApoE-/-組較E-WT組炎癥因子濃度更高,這些說明,單獨刺激脾臟淋巴細胞導致炎癥因子分泌增加,這可能是發生促炎癥反應過程的關鍵,并且ApoE的缺乏可以加重炎癥反應過程,放大炎癥級聯效應。這可能從兩方面來解釋：一方面,ApoE擬肽抑制CD4+T淋巴細胞的增殖[8]。由于缺乏ApoE使其對淋巴細胞增殖的抑制作用解除或減弱,因而ApoE-/-小鼠淋巴細胞大量增殖后炎癥因子表達增加更明顯。另一方面,ApoE-/-小鼠外周淋巴細胞亞群Th1(主要分泌TNF、IFN-γ)、Th17(主要分泌IL-17、IL-22)分化的比例較其他亞群明顯增加[2,9,10]并介導EAE等炎性脫髓鞘疾病過程[11]。因此,ApoE-/-小鼠的Th1/Th17淋巴細胞亞群比例增加最終亦導致其炎癥因子分泌增加較為明顯,進一步加重炎癥反應,從而放大炎癥級聯效應并破壞中樞實質。最近一項動物實驗發現,ApoE擬肽顯著抑制MMP-9的炎癥激活因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β等),從而降低對BBB的降解[12]。另外,在體外BBB模型實驗中,予以TNF-α刺激5 h后BBB滲透性即明顯增加,且Rho/Rho激酶信號通路參與TNF-α誘導的BBB通透性的調節[13]。與動物實驗研究相比,本實驗在體外單獨對脾臟淋巴細胞研究發現,ApoE可以減少脾臟淋巴細胞炎癥因子分泌而調節炎癥反應,再結合諸研究結果,該過程可能通過調節炎癥因子TNF-α、IL-17等相關的Rho/Rho激酶信號通路來調控MMP-9,最終影響BBB滲透性。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是BBB破壞的啟動因素,其中MMP-9是分解BBB重要基質成分的關鍵因素。本研究發現,免疫誘導小鼠后,ApoE-/-小鼠和WT小鼠的淋巴細胞均能分泌MMP-9,且ApoE-/-小鼠較明顯；MOG35-55在體外刺激脾臟淋巴細胞后,E-ApoE-/-組、E-WT組淋巴細胞MMP-9濃度均明顯高于對照組,且E-ApoE-/-組MMP-9濃度較E-WT組更高。說明刺激淋巴細胞可以分泌MMP-9,這將導致BBB基質成分被分解而使BBB完整性破壞,且ApoE的缺乏將導致淋巴細胞MMP-9分泌增加而使BBB破壞更加嚴重。雖然在小鼠體內已證實缺乏ApoE導致EAE小鼠MMP-9的表達及活性增加[7]，使BBB破壞,但細胞層面的機制尚未明了。我們通過體外淋巴細胞的研究發現,ApoE可能抑制了EAE的淋巴細胞MMP-9的分泌,從而發揮保護BBB的作用。目前已經發現,EAE和MS疾病中TNF-α、IL-1β、IL-17等炎癥因子可以誘導MMP-9的表達；炎癥因子主要通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子κB(NF-κB)通路來對MMP-9進行調控[3]。最近一項研究還發現ApoE異構體ApoE4可能會增加NF-κB/MMP-9通路的激活,加劇BBB破壞[14]。因此推測,ApoE可能也通過炎癥因子TNF-α、IL-17相關的MAPKs、NF-κB通路來調節MMP-9的表達,從而影響BBB。

TIMP-1結合活化態MMP-9并抑制后者的活性,MMP-9/TIMP-1二者結合與BBB完整性密切相關,但TIMP-1在MS表現為小幅度地減少或者無變化[15],因此,當TIMP-1無明顯變化時,升高的MMP-9將發揮破壞BBB的作用[16]。我們在體外刺激脾臟淋巴細胞并未發現各組TIMP-1濃度變化的差異,說明了ApoE可能不影響TIMP-1的表達或影響幅度很小,而最終這些升高的MMP-9由于未能被足夠的TIMP-1結合而分解BBB基質使其結構破壞。我們的體外細胞實驗與小鼠的TIMP-1濃度無明顯改變的實驗結果[7,17]是一致的。

目前,神經膠質細胞介導的中樞固有免疫性炎癥反應對BBB的影響以及ApoE參與其中的調節作用已逐漸被報道[17～19],而與諸多研究不同的是,我們通過敲除小鼠ApoE基因,并在體外排除了動物實驗中關于中樞固有免疫細胞(主要是膠質細胞)的炎癥損傷作用的影響,獨立探索了ApoE對脾臟淋巴細胞的影響,這對闡明ApoE通過調節外周免疫性炎癥因子及MMP-9對BBB產生影響是有重要意義的。盡管如此,但我們也還需要進一步在體外的獨立環境中對淋巴細胞亞群在這方面的作用進行探究,尤其是體外細胞研究層面探究Th1/Th17亞型的具體作用情況。

通過我們在體外單獨對淋巴細胞的研究表明,ApoE可以調節EAE抗原刺激的脾臟淋巴細胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-17和基質金屬蛋白酶MMP-9。再結合相關研究報道,ApoE可能通過影響炎癥因子TNF-α、IL-17相關的MAPK、NF-κB、Rho/Rho激酶信號通路等多條途徑來調節MMP-9的表達,進而影響BBB的完整性。但是,其涉及的具體作用仍不完全明確,因此還亟待進一步探究,以期發現ApoE在CNS自身免疫性炎癥疾病中對BBB影響的確切機制。

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