托吡酯對酸敏感離子通道1a調控作用的研究

李 雯， 魏 東

細胞外微環(huán)境pH值的改變對于神經(jīng)細胞發(fā)揮正常的生理功能是非常重要的[1]。在炎癥、缺血、創(chuàng)傷、退行性疾病以及癲癇發(fā)作等神經(jīng)系統(tǒng)病理情況下，厭氧糖代謝造成的乳酸堆積和ATP水解等釋放大量的H+使得組織內pH值極大地降低而出現(xiàn)組織酸化[2～9]，直接或間接導致神經(jīng)元損傷及功能改變[10]。1997年，一種能夠被酸化所激活的陽離子通道-酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)被發(fā)現(xiàn)之后[11]，大量的研究發(fā)現(xiàn)ASICs特別是其1a亞型(ASIC1a)廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)且在神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用[12]，尤其是在癲癇的發(fā)生及發(fā)展領域，ASIC1a已經(jīng)成為一個研究的熱點。托吡酯(topiramate，TPM)作為選擇性電壓依賴的鈉離子通道阻斷劑，是否通過對ASICs的調節(jié)而發(fā)揮抗癲癇作用尚無研究報道，因此，我們采用全細胞記錄膜片鉗及Western blot定量分析TPM對ASICs介導電流的調控作用及對其蛋白表達的影響，來探討ASICs是否是TPM抗癲癇治療的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：懷孕16～17 d的雌性SD大鼠(第四軍醫(yī)大學動物中心)；(2)實驗細胞及質粒：CHO細胞及ASIC1a、ASIC2a及ASIC3 3種質粒(上海交大醫(yī)學院徐天樂老師惠贈)；(3)主要試劑：F12培養(yǎng)基、L型谷氨酰胺等細胞培養(yǎng)相關試劑(美國GIBCO公司)，HilyMax質粒轉染試劑(日本Dojindo Laboratiories公司)，BCA試劑盒(美國Pierce公司)，ASIC1a抗體(美國Milipore公司)，辣根過氧化物酶標記的二抗(美國Milipore公司)，GAPDGH抗體(美國CST公司)，Nacl、Kcl等電生理試劑(美國Sigma公司)。

1.2 胞系的培養(yǎng)及傳代 CHO細胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2孵育箱中內，采用F12培養(yǎng)基加入50 U/ml的青霉素、1 mmol/L L型谷氨酰胺、50 μg/ml的鏈霉素和10%的胎牛血清，觀察細胞生長情況，每2～3 d半量換液。在無菌情況下傳代，先吸棄原有培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加入0.125%的胰蛋白酶消化2～3 min，然后加入含血清的F12培養(yǎng)基終止消化，將貼壁細胞吹打脫落，吹散后進行離心5 min(1000 r/min)，棄上清后，再加入適量培養(yǎng)基，充分吹打重懸，計數(shù)后進行接種備用。

1.3 大鼠皮質神經(jīng)元原代培養(yǎng) 將懷孕16～17 d的雌性SD大鼠進行乙醚氣體麻醉，剪開消毒過的腹壁并暴露子宮，取6～8個胚胎置于玻璃皿中。無菌的情況下從子宮中剖取胎鼠后夾取頭部置于預冷過的DMEM溶液中，解剖顯微鏡下充分剝離腦膜，剝去大腦皮質以外的其它結構。將其剪碎后，加入0.05%胰蛋白酶于37 ℃、5% CO2孵育箱中消化約5 min，加入10%的胎牛血清高糖DMEM溶液終止消化，充分吹打后過濾、1000 r/min，5 min離心，棄上清后加入適量接種培養(yǎng)基充分吹打重懸，計數(shù)后進行接種備用。次日更換半量維持培養(yǎng)基(含2%的B27及1 mmol/L L型谷氨酰胺的Neural basal培養(yǎng)液)，以后根據(jù)細胞生長情況約2～3 d半量更換培養(yǎng)基。

1.4 細胞轉染 培養(yǎng)的CHO細胞融合至70%～80%時進行脂質體轉染，實驗方案根據(jù)HilyMax liposome transfection reagent所提供的操作方法進行。在無菌情況下操作，每個60 mm培養(yǎng)皿加入約7～9 μg質粒；每個35 mm培養(yǎng)皿加入約3～4 μg質粒。轉染4 h后吸棄含脂質體的培養(yǎng)基，PBS洗一次后更換為維持培養(yǎng)基；轉染后的24～48 h內進行蛋白質提取以及電生理實驗。當進行兩種不同的質粒共轉染時，采用相同的質粒量進行配比混合。

1.5 電生理記錄 本實驗電生理采用電壓鉗條件下的全細胞記錄模式。配置電極內液及細胞外液的，玻璃微電極采用兩步垂直拉制方法，使其入水電阻約為3.5～5.5 M。灌流給藥采用“Y”管系統(tǒng)依靠重力實現(xiàn)[13]。實驗時首先給予玻璃電極內施加正壓，通過步進式微操儀將玻璃電極尖端輕壓在細胞表面，撤除正壓，使細胞膜吸附于電極尖端，給予串聯(lián)電阻的自動補償，逐漸給予負壓吸引，施加-60 mV鉗制電壓，待形成超過G級別的巨阻抗后用負壓將細胞膜吸破，使細胞內液與電極內液互通而形成全細胞記錄。所記錄信號通過放大器采集后通過數(shù)模轉換器輸入計算機，使用pCLAMP 9.0軟件進行數(shù)據(jù)采集、設置調整，使用Clampex 9.0進行數(shù)據(jù)分析。

1.6 免疫印跡

1.6.1 樣本制備 將神經(jīng)元接種于60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6～7 d后給于TPM藥物處理24 h，加入RIPA裂解液，冰上刮取細胞后進行冰上裂解15 min，收集裂解液置入EP管中，進行4 ℃低溫離心(13000 r/min)20 min，收集上清，加入SDS上樣緩沖液，金屬浴(95 ℃)煮沸5 min，置于-80 ℃保存。

1.6.2 電泳、轉模及免疫顯色檢測 首先制備SDS PAGE膠進行電泳，結束后用半干轉膜法將蛋白樣品從分離膠中轉移至PVDF膜上，將PVDF膜在20%脫脂奶粉PBST溶液中室溫封閉1 h，然后加入抗體稀釋液配制的一抗(1∶1000)，4 ℃條件下旋轉孵育過夜，加入稀釋配制的二抗(1∶2000)，室溫下孵育2 h，最后在暗室中進行ECL顯色，使用X光膠片顯影，膠片掃描后使用Image Pro Plus 6.1軟件進行圖像分析和數(shù)據(jù)采集。

2 結 果

2.1 TPM對不同ASIC亞單位的調控作用 根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)ASICs的表達模式，在CHO細胞系上分別轉染了ASIC1a、ASIC2a、ASIC1a+ASIC2a和ASIC3質粒，得到ASIC1a同聚體、ASIC2a同聚體、ASIC1a/ASIC2a異聚體和ASIC3同聚體通道。分別對這4種組合進行電生理記錄并給予TPM(300 μM)(見圖1)，發(fā)現(xiàn)不同亞單位組成的離子通道其所通透的內向電流曲線對TPM的反應不同，TPM僅對ASIC1a亞單位組成的同聚體通道有增強調控作用，而對另外3種通道均無明顯的改變。

2.2 TPM對ASIC1a同聚體通道調節(jié)作用 TPM對ASIC1a同聚體通道介導的峰電流的增強效應也具有劑量依賴的特性，劑量越大，效應越大，最大可有近60%的增強效應，其半數(shù)有效劑量約為60 μM(見圖2A)。這種增強效應與胞外酸化程度相關，100 μM的TPM可以增強18%左右pH 6.8誘導的峰電流強度，而在pH 6.0時則約為40%(見圖2B)。隨后我們采取了4種不同的TPM給藥方式：僅與酸共給、僅預給10 s、僅預給10 min、先預給10 s然后與酸共給，發(fā)現(xiàn)必須在與酸共給的情況下才具有增強效應，而兩種僅預給的方式都不能產(chǎn)生增強效應，這就提示TPM的作用具有通道狀態(tài)依賴的特性，只有通道被打開后才能發(fā)揮作用(見圖2C、D)。

2.3 TPM對ASIC1a蛋白的表達作用 我們給于原代培養(yǎng)的神經(jīng)元不同濃度的TPM作用24 h后提取蛋白樣品，通過Western blot定量分析，發(fā)現(xiàn)TPM并不影響ASIC1a的蛋白表達(見圖3A、B)。

圖1 托吡酯對不同ASICs通道內向電流的調控作用

(注：n>6，與給藥前相比*P<0.05，NS表示無統(tǒng)計學差異)

圖2 托吡酯對ASIC1a同聚體通道內向電流的調控作用

(注：n>6， 與給藥前相比*P<0.05 ，NS表示無統(tǒng)計學差異)

圖3 托吡酯對ASIC1a的蛋白表達的影響

(注：n=4，NS表示無統(tǒng)計學差異)

3 討 論

酸敏感離子通道1a(acid-sensing ion channel 1a，ASIC1a)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內表達最廣泛的ASICs家族成員之一，因其分布廣泛、激活閾值較低并能通透鈣離子而受到研究者的重視，當大腦皮質和海馬神經(jīng)元中ASIC1基因被敲除后，原來酸所激活的電流幾乎被全部去除[14～16]，提示ASIC1a是中樞系統(tǒng)神經(jīng)元中ASICs家族主要的功能性亞單位。大量的研究發(fā)現(xiàn)ASIC1a參與了體內眾多的生理及病理過程。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)目前常用的各類藥物中非甾體抗炎藥[17]、麻醉劑利多卡因[18]以及治療多發(fā)性硬化的藥物4-氨基吡啶[19]對ASIC1a的功能具有調節(jié)作用，ASIC1a很可能作為這些藥物的靶點參與了疾病的治療過程之中。那么，托吡酯(topiramate，TPM)作為一種選擇性阻斷電壓依賴的鈉離子通道藥物，在抗癲癇治療的過程中是否也通過ASIC1a發(fā)揮作用的目前尚未報道，本實驗通過全細胞記錄模式及Western blot定量分析探討了TPM對ASIC1a電流和蛋白表達的調控作用，目的在于確定ASICs是否是TPM治療癲癇的可能作用靶點。

有研究發(fā)現(xiàn)ASIC1a非特異性抑制劑阿米洛利能夠延長由鋰-匹羅卡品誘導大鼠癲癇模型發(fā)作的潛伏期時間，提示ASIC1a可能是癲癇治療的重要靶點，但ASIC1a參與癲癇發(fā)作終止的機制尚不明確。有文獻報道癲癇發(fā)作后腦組織中出現(xiàn)明顯的酸中毒，導致組織內環(huán)境pH值下降，繼而激活了抑制性中樞神經(jīng)元上ASIC1a通道，使癲癇發(fā)作終止[20]。也有研究者發(fā)現(xiàn)在小鼠的癲癇模型中干擾ASIC1a表達后，增加了小鼠癲癇發(fā)作的嚴重程度，而在ASIC1a過表達小鼠中出現(xiàn)了相反的結果，這提示可能是由于內環(huán)境的酸化激活ASIC1a而興奮了抑制性中間神經(jīng)元，從而終止了癲癇發(fā)作[21]。

本研究結果顯示，TPM對ASIC1a同聚體通道產(chǎn)生的電流具有增強效應，而對ASICs家族其它3種亞型均無明顯的影響，這種增強效應呈現(xiàn)劑量依賴的特性，隨著藥物濃度的增大，增強的強度也逐漸增大，同時與酸化的程度也呈正相關。那么TPM就有可能通過增強ASIC1a的電流而使抑制性的中間神經(jīng)元興奮，最終實現(xiàn)對癲癇發(fā)作的抑制。因此ASIC1a很可能是TPM抗癲癇作用的靶點之一。

癲癇發(fā)作和癲癇發(fā)生是兩種不同的病理生理過程，我們的研究發(fā)現(xiàn)TPM對ASIC1a同聚體通道產(chǎn)生的電流具有增強效應而推論ASIC1a可能是TPM抑制癲癇發(fā)作的靶點之一，但在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達的ASIC1a在癲癇發(fā)生的病理過程之中扮演什么樣的角色，仍然是未知的領域，需要進一步的研究去探索和明確。

綜上所述：我們發(fā)現(xiàn)TPM僅能增強ASICs家族中ASIC1a組成的同聚體通道所產(chǎn)生的內向電流，而對另外3種通道均無明顯的調控作用；這種增強效應具有劑量依賴的特性，劑量越大，效應越大；并且必須在與酸共給的情況下才能發(fā)揮增強效應；TPM并不影響ASIC1a的蛋白表達。這提示ASIC1a可能是TPM抑制癲癇發(fā)作的作用靶點之一。

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