去鐵胺促進血管內皮祖細胞靶向歸巢和血管化的實驗研究

鄭勝武 黃雄梅 莊兢 林根輝 楊宇 丁昕

[摘要]目的：探討低氧模擬劑去鐵胺（Desferrioxamine，DFO）模擬組織缺氧環境，促進血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells， EPCs）靶向歸巢及促進血管化的可行性，并研究相關的信號通路。方法：分離、培養熒光素酶（luciferase）轉基因Lewis大鼠的EPCs，作為移植細胞備用。實驗動物NOD/SCID裸鼠被隨機分為五組：對照組、EPCs、EPCs-DFO、EPCs-DFO-AMD （AMD3100，趨化因子受體CXCR4抑制劑）、EPCs-DFO-LY（LY294002，磷酸肌醇3激酶（PI3K）抑制劑）組，每組10只。通過結扎裸鼠左側股動脈造成左下肢缺血，經患側股動脈移植EPCs，不同組別分別腹腔注射DFO（100mg/kg/d）、DFO和AMD3100（10mg/kg/d）、DFO和LY294002（20mg/kg/d），連續14d。分別從組織學，分子生物學，細胞學3個方面評價實驗結果。結果：DFO的使用增加了裸鼠缺血下肢的血流灌注，改善了缺血下肢的功能，其新生毛細血管數量明顯高于其他組，并且通過Western Blot檢測觀察到缺血組織中VEGF（血管內皮生長因子），p-eNOS（磷酸化的一氧化氮合酶）和p-AKT（磷酸化蛋白激酶B）的分泌顯著上調。在生物發光成像的研究中，DFO顯著增加了EPCs向缺血患肢的遷移。這些作用均被PI3K抑制劑LY294002所抑制。結論：DFO的使用上調了EPCs向缺血患肢的遷移，改善了缺血患肢的血流灌注以及下肢功能，上調促血管生成因子的分泌，促進缺血組織的血管化，這些作用通過PI3K/AKT信號轉導通路。

[關鍵詞]低氧模擬劑；低氧誘導因子；內皮祖細胞；歸巢；血管化；PI3K/AKT信號通路

[中圖分類號]R329.2 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）12-0116-05

DFO Improves the Homing of EPCs and Neovascularization

ZHENG Sheng-wu，HUANG Xiong-mei，ZHUANG Jing，LIN Gen-hui，YANG Yu，DING Xin

[Fujian Medical University Provincial College of Clinical Medicine（Department of Plastic Surgery，Fujian Provincial Hospital）Fuzhou 350001，Fujian，China]

Abstract： Objective To investigate whether desferrioxamine （DFO） can improve the homing of endothelial progenitor cells （EPCs）and improve neovascularization in ischemic hindlimb of rats. The relevant mechanism was also explored. Methods EPCs of luciferase transgenic Lewis rats were isolated and cultured as transplantation cells. Experimental animal NOD/SCID nude mice were randomly divided into five groups of 10： control， EPCs， EPCs-DFO， EPCs-DFO-AMD （AMD3100， CXCR4 inhibitor）， and EPCs-DFO-LY（LY294002， the PI3K inhibitor） groups. Left hindlimb ischemia was induced by ligating the left femoral artery in nude mice. EPCs were transplanted via the left femoral artery. After cell transplantation， intraperitoneal injection of DFO（100mg/kg/d）， DFO and AMD3100（10mg/kg/d）， DFO and LY294002（20mg/kg/d），were performed respectively to different groups for 14 days. The experimental results were evaluated from three aspects： histology， molecular biology and cytology. Results DFO treatment increased the perfusion of ischemic hindlimb and improved the function of ischemic hindlimb in nude mice. The number of new capillaries was significantly higher than that of other groups. Moreover， VEGF， p-eNOS and p-AKT were significantly increased through Western Blotdetection. In bioluminescence imaging， DFO significantly increased the migration of EPCs to ischemic limbs. All these effects were diminished by LY294002. Conclusion DFO treatment increased the migration of EPCs to ischemic limbs， improved blood perfusion and hindlimb function in ischemic limbs， up-regulated the secretion of pro-angiogenic factors and promoted neovascularization of ischemic tissue. These effects are mediated by the PI3K/AKT signal transduction pathway.

Key words： hypoxia mimetic agent； HIF-1； EPCs； homing； neovascularization； PI3K/AKT signaling pathway

血管新生過程在缺血性疾病中起重要作用，大量的動物實驗證明移植EPCs可以改善缺血組織的血管新生過程[1]。但是最近研究表明外源性EPCs移植后向損傷處的遷移和停留數量較低[2]，這表明單純性的移植EPCs對缺血組織的治療作用不充分。2004年Ceradini發現祖細胞向損傷處的招募是通過HIF-1（Hypoxia Inducible Factor-1，低氧誘導因子1）誘導的SDF-1（Stromal Cell Derived Factor-1，基質細胞衍生因子1）表達，受氧梯度調節[3]。缺氧環境是重要的刺激因素，可以激活HIF-1α，調節下游的SDF-1和VEGF的表達[4-5]，從而進一步調節細胞功能和組織對缺氧環境的回應。SDF-1和受體CXCR4被證明可以促進EPCs招募、增殖，并且調節干細胞的遷移，加速缺血組織的血管化過程[3，6]。

鐵螯合劑DFO用于治療鐵過量等疾病，可以抑制脯氨酰羥化酶的活性，從而穩定HIF-1α的表達[7]，在實驗中常作為低氧模擬劑。最近的動物實驗研究表明DFO可以加速缺血組織的血管化[8-9]。本實驗應用DFO模擬組織缺氧環境，研究DFO是否可以促進EPCs向缺血缺氧區域的遷移歸巢，從而促進缺血組織的血管化，同時研究該過程的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器：3周齡熒光素酶轉基因Lewis雄性大鼠5只，由日本Jichi醫學院提供。8周齡雄性NOD/SCID裸鼠50只，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。淋巴細胞分離液（Sigma-Aldrich，美國），Mouse Anti-CD34（Santa Cruze，美國），Rabbit Anti-CD133（Abcam，美國），Mouse Anti-CD31（Dako，美國），Mouse Anti-KDR（Abcam，美國），Goat Anti-rabbit 488（Invitrogen，美國），Goat Anti-mouse 488（Invitrogen，美國），Goat Anti-rabbit 555（Invitrogen，美國），Goat Anti-mouse555（Invitrogen，美國），Rabbit Anti-α-SMA（Abcam，美國），Rabbit Anti-Luciferase（Abcam，美國），熒光素酶底物（Promega，美國），CO2培養箱（Beckman，美國），流式細胞儀（BD，德國），恒倒置相差顯微鏡（Nikon，日本），熒光顯微鏡（Nikon，日本），IVIS Imaging System（Xenogen，美國），激光散斑成像（Moor Instrument，英國）。

1.2 細胞分離、培養及鑒定

1.2.1 EPCs的分離與培養：3周齡雄性luciferase轉基因Lewis大鼠，用10%水合氯醛過量麻醉處死。分離出股骨、脛骨和肱骨，用冷PBS沖出骨髓，然后用PBS將細胞洗滌3次。15ml離心管底部加入3ml淋巴細胞分離液，上層加入骨髓細胞混懸液，用密度梯度離心法分離細胞，PBS洗滌3次。在收集的單個核細胞中加入CD34單克隆抗體10μl， 混勻后4℃孵育30min；工作液（PBS+5%胎牛血清）重懸，1 500r/min離心5min，共離心2次；收集細胞，加入100μl工作液，加入磁珠二抗10μl，搖勻后4℃孵育30min；通過MACS磁性分離柱，獲取CD34+細胞；EGM-2MV重懸，調整細胞濃度至107/ml，接種于直徑10cm的培養皿內，37℃、5% CO2培養箱內培養；原代細胞3d換液，去除未貼壁的細胞，待細胞長滿后傳代培養。

1.2.2 攝取DiI-Ac-LDL（熒光標記的乙酰化低密度脂蛋白）試驗：將分離培養3d的CD34+細胞接種于蓋玻片上；細胞爬片約有60%融合率時取出爬片，PBS漂洗5min，共3次；加入10μg/ml的DiI-Ac-LDL，37℃避光孵育3h；熒光顯微鏡觀察，計數染色陽性的細胞比例。

1.2.3 流式分析細胞表面標記物變化：將細胞（2×105）與稀釋的抗體混合，包括CD34（1：100），CD133（1：200）和KDR（1：200）抗體，置于4℃，孵化30min；以1 500r/min離心5min，清洗2次，棄上清，PBS重懸；加入二抗孵化30min，稀釋比例1：500，PBS重懸，以1 500r/min離心5min，清洗2次；流式細胞儀檢測，并用FCS Express 4軟件分析結果。

1.3 動物模型制備、細胞移植及實驗分組

1.3.1 動物模型制備：裸鼠下肢缺血手術模型參考以前的報道制備[10]。

1.3.2 EPCs移植：將裸鼠按體重以0.5mg/g戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉；在左大腿中間處縱行切開皮膚，暴露并分離股動、靜脈，在股動脈的近端用10-0的尼龍線結扎；用帶有29G針頭的1ml注射器從股動脈近端刺入，將2×105（總量200μl）個細胞通過股動脈注射進入全身循環；迅速用10-0尼龍線結扎股動脈的遠端，剔除此段股動脈；7-0尼龍線縫合皮膚，將裸鼠放回籠內飼養。

1.3.3 實驗分組：將實驗動物隨機分成5組，每組10只，觀察14d：①對照組：PBS組；②EPCs組：移植2×105個EPCs；③EPCs-DFO組：移植2×105個EPCs，術后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d；④EPCs-DFO-AMD組：移植2×105個EPCs，術后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d，AMD3100 10mg/kg/d；⑤EPCs-DFO-LY組：移植2×105個EPCs，術后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d，LY294002 20mg/kg/d。

1.4 下肢狀態評價：將缺血下肢分為完全成活，足部壞死和下肢截肢3種，分別統計各組中3種類型的數量，并進行統計學分析。

1.5 激光散斑血流成像儀檢測下肢血流灌注：FLPI（Full-Field Laser Perfusion Imager激光散斑成像）裝置放于溫和（24℃）及安靜的環境中，CCD照相機放置在高于待測組織表面25cm處，相機曝光時間設置為20ms，保證每次檢查時設置一致。分別檢測術后當日，第3、7和14天觀察缺血下肢血流灌注情況。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠，靜置10min，待呼吸平穩后，用激光散斑血流成像儀進行下肢血流檢測，觀察下肢的血流灌注范圍及強度。通過MoorFLPI 2.0記錄圖像，紅色表示血流較強區域，藍色表示血流較少的區域。用該軟件進行數據分析，為了去除測量的偏倚，計算下肢灌注血流比值。灌注血流比值=患肢血流/正常下肢血流。

1.6 生物發光成像技術：為了檢測移植細胞在體內的分布情況，分別在術后即時、3d、7d和14d進行檢測。每只裸鼠腹腔注射D-Luciferin（150mg/kg），10min后將裸鼠置于麻醉箱內，2.5%的異氟烷吸入麻醉，將麻醉好的裸鼠置于成像的CCD暗室中，成像2min。通過Caliper Life Sciences分析數據，在生物發光獲得的圖片中，紅色代表光子信號最強，藍色代表光子信號最弱，以未注射細胞的裸鼠成像后得到的數值作為基線，超過基線的為有效數據，低于基線的為背景值。

1.7 免疫熒光染色：術后第14天頸椎脫位處死裸鼠，取下缺血下肢的大腿肌肉，OCT包埋組織，制備7μm冰凍切片進行免疫組化分析；0.1% BSA 1：50稀釋一抗抗體：CD31、α-SMA、CXCR4和兔抗熒光素酶，4℃孵化過夜；滴加熒光二抗Goat Anti-Mouse或Goat Anti-Rabbit，1：500稀釋，37℃放置1h，PBS搖床晃洗3次，每次15min；DAPI 1：1 000稀釋滴加于切片上，染色5s，PBS清洗5min，共3次，熒光封片劑封片，-20℃保存；熒光顯微鏡拍照，Image-Pro plus 6.0分析圖像。

1.8 Western Blot檢測組織中細胞因子：從缺血下肢內收肌中提取的總蛋白用10% SDS-PAGE電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上，將膜放在PBS中漂洗1次，浸入0.5% BSA封閉，室溫封閉1h以上。將一抗用0.5% BSA稀釋：p-AKT（1：500）， AKT（1：500）， VEGF（1：1 000），SDF-1（1：1 000）， HIF-1（1：500）， p-eNOS（1：500）， eNOS（1：500）， GAPDH （1：1 000），將膜浸入其中，4℃過夜。洗膜，用0.5% BSA 1：500稀釋二抗，室溫孵育1h。洗膜，把膜與Super Signal Western blotting化學發光底物在室溫下孵育5min，暗室內曝光X光片，然后顯影定影。

1.9 統計學分析：使用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差的形式表示。當方差齊時，兩兩比較采用LSD-t檢驗，組間（n>2）比較采用單因素方差分析；方差不齊時，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗，多重檢驗校正采用Bonferroni校正。以α=0.05為檢驗水準，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉基因大鼠骨髓來源的EPCs形態及鑒定：分選后的細胞貼壁生長早期細胞多為長梭形，貼壁后生長迅速，呈克隆樣生長；至8～9d，細胞的形態由梭形變成多角形并融合成片狀，形成類似成熟血管內皮細胞形態，呈典型的“鋪路石”樣外觀。細胞表現了較強的攝取DiI-Ac-LDL能力，熒光顯微鏡下觀察DiI-Ac-LDL熒光染色占貼壁細胞的（88.75±1.2）% 。應用流式細胞分析進行細胞表型的鑒定，CD34陽性率為（64.95±4.06）%，CD133陽性率為（90.5±2.27）%，KDR陽性率為（30.79±1.93）%。結果表明培養得到的細胞為EPCs。

2.2 DFO促進缺血下肢再血管化

2.2.1 下肢狀態評價：術后第14天觀察缺血下肢狀態，EPCs-DFO組有6.7%的裸鼠缺血下肢發生截肢，足部壞死發生率為33.3%，60%的裸鼠缺血下肢完好，明顯高于其他組。在EPCs-DFO-LY組下肢發生截肢的比例最高，為73.8%。該結果表明DFO的應用顯著減少了下肢壞死的發生幾率，該作用可被LY294002抑制。見圖1。

2.2.2 下肢血流灌注檢測：術后第14天血流灌注率分別為：對照組（39.39±0.03）%、EPCs組（60.67±0.03）%、EPCs-DFO組（80.63±0.03）%、EPCs-DFO-AMD組（65.89±0.05）%、EPCs-DFO-LY組（34.49±0.05）%。EPCs-DFO 組缺血下肢的血流在術后第14天明顯高于其他組，缺血下肢血流恢復明顯。EPCs-DFO-AMD組和EPCs組術后第14天血流灌注情況明顯好于對照組和EPCs-DFO-LY組。結果表明DFO改善了缺血下肢的血流灌注情況，該作用被LY294002抑制。見圖2。

2.2.3 血管密度計數：CD31特異性染色標記小血管和微血管，α-SMA特異性染色標記動脈。在EPCs-DFO組毛細血管密度計數和動脈密度計數明顯高于其他組，EPCs-DFO-AMD和EPCs組的血管密度計數也明顯高于對照組，而LY294002抑制血管新生。見圖3。

2.3 DFO對外源性EPCs的影響

2.3.1 生物發光成像檢測EPCs在體內的分布：帶有luciferase標記的EPCs通過股動脈注射移植入裸鼠體內，移植的細胞早期聚集于裸鼠的肺部以及缺血下肢，在隨后的3d中肺內的信號逐漸下降至消失。術后14d，EPCs-DFO組缺血下肢的光子信號強度明顯高于其他組，表明較多的細胞聚集于此，這種作用被AMD3100和LY294002所抑制。見圖4。

2.3.2 外源性EPCs在缺血下肢的分化以及CXCR4的表達：免疫熒光染色觀察到移植的外源性EPCs分化成血管內皮細胞參與了組織的修復。進一步觀察術后14d組織切片CXCR4的表達，EPCs-DFO的CXCR4表達明顯高于其他組，該作用被LY294002所抑制。這些結果表明DFO促進EPCs向損傷處的遷移，通過自身分化促進血管生成。見圖5。

2.4 Western Blot檢測組織中細胞因子：在DFO的刺激下觀察缺血組織中各種蛋白的表達，EPCs-DFO組HIF-1α較其他組表達更高，其下游的p-AKT，VEGF，SDF-1和p-eNOS也出現高表達，EPCs組和EPCs-DFO-AMD組蛋白的表達情況相似，高于對照組，LY294002抑制這些蛋白的表達。結果表明DFO刺激促血管生成因子的表達，這種作用被PI3K抑制劑LY294002所抑制。見圖6。

3 討論

EPCs在血管化過程中起重要作用，尤其在缺血環境中。EPCs移植發揮作用主要通過EPCs向缺血或創傷組織遷徙，分泌一類促進血管新生的因子和直接分化為血管內皮細胞參與新的血管生成而發揮治療作用[11-12]。因此，EPCs向缺血或創傷部位的靶向歸巢是其發揮作用的重要前提。

目前干細胞歸巢的機制仍不能完全明確，主要的分子機制包括：SDF-1/CXCR4信號軸、HGF/c-met信號軸、MCP-3/CCR1、3、5信號軸以及黏附因子等[13]，其中SDF-1/CXCR4信號軸通路是目前研究最多的一種機制。SDF-1被認為是重要的趨化因子，招募干細胞向損傷處遷移。SDF-1/CXCR4的激活可以上調EPCs向缺血損傷處的遷移，進一步促進血管化[14]，可以通過提高靶組織SDF-1的含量和/或上調CXCR4的表達[15]，來促進干細胞歸巢。研究表明缺氧環境可以通過激活SDF-1，增加EPCs的遷移，刺激缺血組織血管化[3]。DFO通過穩定HIF-1α蛋白模擬缺氧環境，激活SDF-1及下游基因表達[16]。因此DFO可能成為一種新的方法促進EPCs歸巢。

在本實驗中，筆者證實了DFO的應用顯著減少了下肢壞死的幾率，改善了缺血下肢的血流灌注情況，增加了缺血組織的毛細血管密度和動脈密度，結果證明了DFO可以促進缺血下肢再血管化。通過移植帶有熒光素酶報告基因的EPCs，應用生物發光成像技術動態觀察細胞的遷移，發現移植的外源性EPCs向損傷處遷移。在移植早期，細胞主要分布在肺內及向損傷處聚集。術后14d，DFO組缺血下肢的光子信號強度明顯高于其他組，表明較多的EPCs聚集于此，結果證明DFO的應用促進了EPCs向損傷缺血組織的靶向歸巢。通過免疫熒光染色觀察到移植的外源性EPCs分化成血管內皮細胞，參與了組織的修復，并且DFO組的CXCR4表達明顯高于其他組。通過WB檢測發現DFO組的各種促血管生成因子的表達高于其他組。因此，應用DFO是一種有效地促進EPCs向損傷處遷移、靶向歸巢的策略。

在多種類型的細胞研究中發現 PI3K/AKT信號轉導通路在細胞增殖、遷移和存活方面中起重要作用。Zheng[17]報道PI3K/AKT/eNOS信號轉導通路在SDF-1誘導的EPCs遷移中起調控作用，Jiang[18]報道PI3K信號可以調控VEGF的表達，Dimmeler[19]報道PI3K信號在血管化過程中激活eNOS。因此，PI3K/AKT通路可能與血管化過程相關。在本實驗中，DFO促進血管化和EPCs靶向歸巢的作用以及促進SDF-1、CXCR4、p-AKT、p-eNOS高表達的作用均能夠被PI3K/AKT抑制劑LY294002和CXCR4拮抗劑AMD3100所廢除或部分抑制。AMD3100雖然是CXCR4受體的拮抗劑，但是被證明可以促進血管新生過程，抑制血管生成過程[20]，本文的實驗結果與文獻報道相符。LY294002作為PI3K抑制劑，能夠廢除DFO促進EPCs靶向歸巢和血管新生的作用，表明DFO對EPCs遷移的影響與PI3K/AKT信號轉導通路相關，實驗結果與Peyvandi[21]的報道相符。

總之，DFO作為低氧模擬劑，是用于治療缺血性疾病的一種有潛力的藥物，其作用機制是通過穩定HIF-1α的表達，模擬低氧環境，激活PI3K/AKT信號通路，上調下游SDF-1、VEGF等因子的表達，促進EPCs的歸巢，提高缺血組織血管化，改善缺血組織血流灌注。

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[收稿日期]2018-10-19 [修回日期]2018-11-11

編輯/賈敏