米非司酮對人子宮內膜細胞凋亡及促血管生成因子表達的影響

李秋芳

[摘要]目的為了解米非司酮對子宮內膜細胞的毒性，探討使用米非司酮后子宮內膜細胞凋亡情況以及促血管生成因子水平變化情況。方法取培養的人子宮內膜細胞，觀察不同濃度米非司酮的細胞毒性情況，以染色流式細胞術檢查細胞凋亡的全科，同時使用實時熒光定量聚合酶鏈反應觀察米非司酮對促血管生成因子水平的影響。結果發現隨著藥物濃度上升，細胞死亡率增加、細胞解體、排列紊亂現象嚴重；米非司酮對基因pro-Caspase3表達有抑制作用，藥物對Ang-1表達有抑制效果，對VEGF、Ang-2表達有促進效果。結論米非司酮可能通過調控pro-Caspase3表達促進人子宮內膜細胞凋亡有效果，同時此藥抑制機體Ang-1表達、增加VEGF、Ang-2表達。

[關鍵詞]子宮內膜；促血管生成因子；米非司酮；細胞凋亡

[中圖分類號]R711.52 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2017）17-33-04

米非司酮是臨床圍絕經期功血常用治療藥物，功血發病與神經系統和內分泌系統功能失調有關，而米非司酮能增加機體內孕酮水平、抑制子宮內膜增生，從而有效控制出血，臨床實踐發現若連續用藥3個月以上，易造成閉經情況。有學者認為造成閉經現象發生與米非司酮促細胞凋亡有關，但目前臨床對這方面研究較少，故本文觀察米非司酮對子宮內膜細胞凋亡、促血管生成因子表達的影響，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

實驗試劑：實時定量PCR試劑盒（Takara）、Caspase3抗體（Cell Signaling）、米非司酮（Sigma），DMEM/F12培養基，人子宮內膜細胞（中科院實驗室）。

細胞培養：將細胞放于含有10%胎牛血清的培養基中，后將培養基置于保溫箱中培養，條件設置為溫度37℃、飽和濕度、二氧化碳體積分數為5%，以不同濃度（5、10、15μg/mL）米非司酮對細胞進行處理，在細胞培養48h后用電學顯微鏡觀察細胞生長情況。

1.2方法

1.2.1實時定量PCR檢測 將經15μg/mL米非司酮處理的子宮內膜細胞培養2d后，使用realtime-PCR檢測細胞內促血管生成因子VEGF、Ang-2、Ang-1表達量，本次檢測嚴格按照說明書對細胞進行裂解并提取RNA，后將RNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR反應，最后使用PCR儀對PCR擴增，參數為94℃2min，94℃20s，50℃-60℃20s，60℃40s，如此重復40次，讀取Ct值，計算出相對表達量，檢測重復3次，取平均值。

1.2.2細胞凋亡檢測 將細胞以不同濃度米非司酮藥物進行處理，后經消化、離心以流式細胞儀以及試劑盒（AnnexinV-FITC/PI），檢測子宮內膜細胞凋亡情況，判斷標準：早期凋亡結果為Annexin V⁺/PI一，晚期死亡為Annexin V⁺/PI⁺，總凋亡率為兩種凋亡率之和。 1.2.3細胞凋亡基因Caspase3蛋白表達檢測 以15μg/mL米非司酮處理細胞，并培養2d，后裂解取細胞蛋白，為計算蛋白濃度使用BCA法，繪制稀釋后蛋白濃度曲線，以10%聚丙烯酰胺凝膠對等量蛋白樣品進行電泳分離，并轉印至PVDF膜上。加入封閉液封閉2h環境條件為室溫，2h后加入兔抗人β-actin稀釋液、一抗Caspase3稀釋液，在4℃溫度下孵育過夜。用PBST沖洗3次，后加入有HRP標記的羊抗兔二抗稀釋液（按1：7500），室溫孵育1小時，再以PBST洗3次，加入電化學發光底物，使用成像儀拍照，本次使用的PBST為PBS溶液加上Tween-20。

1.3觀察指標

觀察不同濃度米非司酮刺激下子宮內膜細胞生長情況以及凋亡情況，同時檢測藥物對細胞內促血管生成因子水平變化的影響，同時觀察細胞凋亡因子pro-Caspase3以米非司酮處理后表達情況。

2結果

2.1細胞在以不同濃度米非司酮刺激后生長情況

藥物劑量越大細胞解體、排列紊亂現象越嚴重，見圖1。

2.2藥物對細胞凋亡基因pro-Caspase3表達的影響

米非司酮對基因pro-Caspase3表達有抑制作用，見圖2。

2.3子宮內膜細胞凋亡與不同濃度藥物的相關性

對照組細胞凋亡率為（3.27±0.35）%，經5、10、15μg/mL米非司酮處理后，細胞凋亡率分別為（10.42±0.84）%、（12.67±1.32）%、（18.75±1.53）%，結果表明藥物濃度約大細胞凋亡率越高，見圖3。

2.4米非司酮對促血管生成因子表達的影響

藥物對Ang-1表達有抑制效果，對VEGF、Ang-2表達有促進效果，見圖4。

3討論

米非司酮是臨床強效抗孕激素的藥物，多用于催經止孕、功血、抗早孕、死胎引產以及宮內節育器取出、刮宮術等治療中，其不僅能抑制子宮內膜增生、分化，還對內膜退化、凋亡有促進作用，同時對絨毛、蛻膜組織有破壞效果，能降低機體血孕酮水平，使黃體萎縮、前列腺素釋放。但目前臨床對藥物治療作用機制尚未完全了解，本次通過觀察內膜細胞經米非司酮刺激后生長、凋亡情況以及相關因子水平表達情況，來分析藥物作用。

本次觀察不同濃度藥物處理后細胞生長、凋亡情況，發現隨著藥物濃度上升，細胞死亡率增加。有研究表明子宮內膜增生與子宮內膜細胞凋亡有密切關系，細胞凋亡不足會使細胞增殖失控，導致增生，子宮內膜過度增生會引發圍絕經期子宮出血，而過度凋亡則會引發萎縮癥，本次研究顯示米非司酮藥物濃度增加有促細胞凋亡效果，提示此藥可能通過加速內膜細胞凋亡，從而產生抑制內膜增生作用，進而達到治療目的。同時在藥物處理細胞48h后，觀察細胞生長情況，發現內膜細胞數量減少且細胞形態出現明顯改變。結果提示米非司酮對細胞毒性與給藥時間長短、用藥劑量多少有關，大劑量使用藥物會造成細胞出現解體、排列紊亂等情況，因此臨床在用藥時為避免毒性增強，需要避免長時間、大劑量用藥。Ang-1、Ang-2為血管生成調節因子，其中前者能與內皮細胞中Tie-2受體結合，使受體磷酸化，從而產生抑制細胞凋亡的效果，而后者能抑制前者功能，使血管重構，VEGF能與Ang-2產生協同作用促進新血管生成。本次研究結果顯示使用藥物后Ang-1表達降低、VEGF、Ang-2水平上升，結果提示米非司酮通過提高內皮細胞內VEGF、Ang-2水平，從而促進血管生成，改善患者功血癥狀。同時本次研究發現15μg/mL米非司酮處理細胞后48h，pro-Caspase3表達量明顯較對照組降低，Caspase3為執行細胞凋亡的效應蛋白，有研究表面pro-Caspase3表達量與細胞凋亡率呈負相關性，本次研究結果提示米非司酮可能通過調控pro-Caspase3表達，來促進細胞凋亡，以抑制子宮內膜增生，改善患者功血情況。

綜上所述，米非司酮對人子宮內膜細胞凋亡有促進效果，其可能通過調控pro-Caspase3表達，達到促細胞凋亡的目的，同時此藥抑制機體Ang-1表達、增加VEGF、Ang-2表達，能促進血管生成。

（收稿日期：2017-05-09）