羅田板栗褐變產物的分離及穩定性研究

李琳玲+鄭永良+張雪華

摘要：研究以羅田板栗（Castanea mollissima）為研究材料，通過傳統的回流提取法提取栗仁中的主要褐變物質并進行穩定性研究。結果表明，其最佳提取工藝條件為乙醇體積分數70%、提取時間5 h、提取溫度45 ℃；蒽醌類物質在20～80 ℃溫度下含量較為穩定；80 W紫外線對蒽醌類物質影響較大；5%谷氨酸鈉使蒽醌類含量快速下降。

關鍵詞：板栗（Castanea mollissima）；酶促；褐變物質；蒽醌類化合物；穩定性

中圖分類號：S664.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）01-0093-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.024

Abstract： In this study，the research material is Luotian chestnut. The browning material in chestnut are extracted by conventional reflux extraction and conducted stability study. The results showed that the optimum extraction conditions were determined in 70% ethanol， the extraction time in 5 hours， extraction temperature on 45 ℃. The content of anthraguinone was stable at 20～80 ℃. Also found that 80 W UV had great influence on anthraquinones and 5% glutamate into anthraguinone content declineal rapidly， food additives in the conclusion.

Key words： chestnut（Castanea mollissima）； enzymatic； browning substances； anthraquinone； stability

板栗（Castanea mollissima）屬殼斗科栗屬植物，為中國傳統干果之一。目前，板栗分布于北半球的亞洲、歐洲、非洲和美洲大陸[1，2]。湖北省羅田縣是中國南方重要的板栗主產區，栽培面積4.8萬hm2，年產板栗約3.0萬t左右，板栗產業年產值達4.8億元，在當地經濟發展中起著不可替代的作用[3]。

板栗屬頑拗性種子，采后極易發生褐變和衰老，造成嚴重的經濟損失[4]。板栗在加工過程中，去皮、機械損傷、切分磨碎或長時間暴露放置均易使果肉發生褐變。褐變除了造成外觀色澤改變，也會造成風味與口感變化及營養物質的損失，大大降低了商品價值[5]。一般認為，果蔬發生褐變是由于采收和采后處理過程中造成了不同程度的損失，細胞內原本隔離的酚類物質和酶相互接觸，同時大量氧氣通過傷口進入，酚類物質氧化成蒽醌類，從而聚合成黑色素類物質[6]。中國作為板栗生產大國，許多科研工作者針對控制板栗加工貯藏中的褐變進行了研究[7-9]。近年來，為了提高板栗的商品價值，中國科研工作者開展了板栗深加工產品的研發，如板栗罐頭、板栗果脯、板栗蓉、板栗醬等，這些產品開發都受到褐變問題的制約，因此解決褐變問題是板栗深加工的關鍵。研究以中國板栗第一縣——羅田紅光油栗作為研究材料，探討板栗深加工過程中，溫度、提取時間、光照、主要食品添加劑對板栗蒽醌類物質穩定性產生的影響，以期為板栗深加工工藝提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

板栗采自湖北羅田，果實大小、著色、成熟基本一致，無病蟲害和損傷，品種為紅光油栗。

1.2 主要試劑及設備

試劑：無水乙醇、無水甲醇、氯仿、硫酸、醋酸鎂、去離子水。

儀器：RE52-99型旋轉蒸發儀，SHZ-O（III）型循環水式真空泵，TU-1810型紫外可見分光光度計，8F-06A型索式提取器，恒溫箱，電子天平等。

1.3 方法

1.3.1 板栗栗仁褐變的方法 板栗栗仁發生酶促褐變的多酚氧化酶的最適反應溫度一般為40～60 ℃[10]，但同時要考慮到溫度過高可能會引起其他非酶促褐變，影響試驗結果。因此，先將生板栗剝殼，然后將板栗仁打碎放置在45 ℃的恒溫箱里5～7 d，使其充分發生褐變，并作為待提取樣品。

1.3.2 板栗仁褐變產物的提取分離方法 提取蒽醌類化合物時選用的方法是索式提取法，先稱取適量板栗粉樣品，用兩層紗布將其包裹好，塞入到提取管中，且不能超過虹吸管的最高處，然后在提取瓶中加入乙醇溶液，一般不超過提取瓶2/3，設置適當溫度開始回流提取[11]，得到粗提取液。然后通過旋轉蒸發儀將得到的粗提取液在70 ℃下減壓回收乙醇溶液，該過程最需要注意的是先減壓，再開動電機轉動蒸餾燒瓶，結束時，應先停電動機，再通大氣，以防蒸餾燒瓶在轉動中脫落。待乙醇蒸發出去后，將得到的提取液加入20%硫酸，其目的是由于蒽醌化合物一般都是與糖等物質形成結合物，通過硫酸使其水解為游離苷元，以便萃取。利用氯仿萃取，再通過旋轉蒸發儀回收氯仿（36 ℃）得到蒽醌提取液。

1.3.3 蒽醌含量的測定

1）顯色劑的配制。稱取0.4 g MgAc，加入甲醇溶液配制成100 mL，即可得到0.5%的醋酸鎂-甲醇溶液，充分搖勻待用。

2）標準曲線的制備。標準稱取1，8-二羥基蒽醌100 mg，用甲醇溶解并定容為100 mL標準液，分別吸取10、25、50、100、150、200、250 μL標準溶液，加0.5%醋酸鎂-甲醇溶液定溶至10 mL，充分搖勻后于510 nm處測定吸光度[12]。并以0.5%醋酸鎂-甲醇溶液作空白對照，測定結果見表1。結果表明，1，8二羥基蒽醌標準溶液在1.000～25.000 mg/L吸光度呈現良好的線性關系（r=0.998 8），其濃度-吸光度關系的回歸方程為A=0.046 6C+0.000 6。其中A為吸光度，C為板栗褐變產物（蒽醌類物質）的濃度（mg/L）endprint

1.3.4 板栗褐變產物（蒽醌化合物）的含量測定 按上述工藝將提取液離心后，按一定的比例稀釋，在510 nm測定吸光度，并根據標準回歸方程計算出蒽醌化合物的提取率。

蒽醌化合物提取率=CV/1 000 W×100%

式中，V為提取液的體積（L），W為板栗粉的用量（g）。

2 結果與分析

2.1 提取試驗的優化設計

2.1.1 提取溫度對蒽醌類物質提取率的影響 以提取溫度作為研究因素，蒽醌提取率（mg/L）作為參考指標，以80%乙醇作為溶液，分別在35、40、45、50、60 ℃下進行試驗，每組提取5 h。根據結果繪制曲線（圖1）可明顯看出，隨著溫度提高蒽醌類物質的提取率在明顯增加，且在40～50 ℃存在明顯的增長速度最高點，溫度過高會引起其他的一些非酶促反應，會影響蒽醌的提取率，因而選取45 ℃更為適合。

2.1.2 提取時間對蒽醌類物質提取率的影響 以提取時間作為研究因素，蒽醌提取率作為參考指標，以80%乙醇作為溶液，分別在2、3、5、6、7 h下進行試驗，每組在45 ℃下提取。由圖2可以看出，隨著提取時間的增加，提取率也越來越高，同時逐漸趨近于最大值，因此提取時間選取5 h為宜。

2.1.3 乙醇體積分數對蒽醌類物質提取率的影響 以乙醇體積分數作為研究因素，蒽醌提取率作為參考指標，在45 ℃下提取5 h，乙醇體積分數分別為50%、60%、70%、80%、90%進行試驗。由圖3可知，乙醇體積分數對提取率有很明顯的影響，隨著體積分數的增大提取率先逐漸增大，然后再逐漸減小。故選用70%乙醇。

2.2 蒽醌類物質的穩定性研究

由于板栗的藥用價值極高，目前市場上以板栗為原料的食品也層出不窮，板栗的褐變卻嚴重影響板栗的食用價值。對蒽醌類物質的穩定性進行分析研究有助于對板栗褐變的控制。

2.2.1 溫度對蒽醌類物質的穩定性研究 分別取濃度為5、10、15 mg/L蒽醌類物質各5組分別放置于20、40、60、70、80 ℃恒溫箱中7 d，并用紫外分光光度計測量蒽醌類物質吸光度。由表2可以看出，隨著溫度的不斷變化吸光度的改變不明顯，即溫度對蒽醌化合物的穩定性的影響不大。因此，在板栗的生產過程中，對于防褐變的措施上，不必過多的考慮溫度對褐變的影響。

2.2.2 光照對蒽醌類物質穩定性的影響 分別取濃度為5、10、15 mg/L蒽醌類物質各4組，分別置于黑暗、40 W白熾燈、100 W白熾燈、80 W紫外線下照射處理7 d，測定其吸光度，試驗結果見表3。由表3可知，光照對蒽醌類物質的穩定性有較強的影響，且隨著光照的增強其吸光度越來越小，也就是濃度越來越低。特別在紫外光下，其濃度降低非常明顯，穩定性最差，在儲存過程中一定要注意光照條件。

2.2.3 食品添加劑對蒽醌類物質穩定性的研究 分別取濃度為5、10、15 mg/L蒽醌類物質各4組，分別添加5%的檸檬酸、氯化鈉、谷氨酸鈉、維生素C放置7 d，分別測定其吸光度，試驗結果見表4。以上4種添加劑對于蒽醌類物質的穩定性都有影響，吸光度均有所下降，因此在板栗食品的加工生產中，加入適當添加劑，在一定程度上可為食品護色，同時也可以防止板栗褐變。

3 討論

3.1 分離試驗

目前，針對果蔬中蒽醌類化合物提取及褐變開展了很多研究。何英等[13]開展關于石榴果皮酶促褐變產物的提取、分離與結構鑒定，通過試驗確定了最佳提取工藝為75%乙醇作為提取劑，提取時間25 min，提取溫度為25 ℃。并做了超聲波提取與傳統提取的對比。香蕉酶促褐變研究結果顯示，75 ℃水浴處理5 min，或100 ℃處理20 s可以鈍化PPO活性，從而降低褐變[14]。楊心宇等[15]對板栗仁酶促褐變產物進行了提取并對其穩定性進行了研究，確定水浴回流法提取酶促褐變產物最佳工藝條件為乙醇體積分數75%，提取時間為6 h，料液比為1∶2，提取溫度為45 ℃。本研究對于板栗褐變產物的提取分離得到的最佳提取工藝為提取液乙醇體積分數70%，提取時間5 h，提取溫度45 ℃，與以上各個最佳提取工藝相比有所區別，最明顯的是乙醇體積分數和提取時間，很可能是因為不同地區板栗蒽醌類物質含量不同所導致的差異。

3.2 穩定性試驗

大部分果蔬中都存在蒽醌類物質，它是導致果蔬褐變的主要因素。目前單獨針對蒽醌類物質穩定性研究不多見。魏玉輝等[16]研究發現隨著時間的變化，蒽醌類物質的含量幾乎不變，較為穩定。楊芙蓮等[17]研究發現pH對蒽醌類物質的影響極大，從而得出了通過調節pH來阻止褐變的發生。陳德經[18]研究認為，板栗仁黃色素在黑暗和日光照下變化不大，但在白熾燈光及紫外照射下，色素的穩定性較差。本研究主要從溫度、光照、食品添加劑3個方面進行了試驗，發現光照、食品添加劑對蒽醌的穩定性有較大的影響，溫度影響較小。在光照對蒽醌物質的影響中，紫外線對蒽醌的影響較為顯著。同時也可添加一定的食品添加劑，使其發揮更好的保存效果。但是添加劑是否會和板栗中一些成分結合形成對人體有害的物質，有待更深入的研究。

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