Fas/FasL與嬰幼兒血管瘤演變過程的關(guān)聯(lián)性研究

趙忠芳　張波　馬少林

[摘要]目的：研究（Fas/FasL自殺相關(guān)因子，factor associated suicide/factor as sociated suicide lire）表達(dá)在嬰兒血管瘤演變過程中每個階段的表達(dá)量并探求它們之間的關(guān)聯(lián)性。方法：選取在筆者醫(yī)院保存的嬰幼兒血管瘤病例標(biāo)本60例，并依據(jù)標(biāo)本所處血管瘤病理形態(tài)將其分成六個階段，采用EnVi sion免疫組化法和RT-PCR方法檢測Fas和FasL蛋白及mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：Fas蛋白在增生早期和中期時有部分表達(dá)量，在增生晚期時陽性細(xì)胞增多并且Fas mRNA表達(dá)量達(dá)到最大，從消退早期至晚期，F(xiàn)as表達(dá)量呈下降趨勢；FasL蛋白從增生中期開始出現(xiàn)表達(dá)，當(dāng)?shù)皆錾砥跁rFasL mRNA表達(dá)量最大且FasL蛋白表達(dá)量達(dá)到最大，從消退早期到晚期，F(xiàn)asL表達(dá)量呈下降趨勢。結(jié)論：Fas和FasL通過介導(dǎo)血管瘤細(xì)胞凋亡途徑來使嬰幼兒血管瘤自行消退，它們之間存在著密切聯(lián)系。

[關(guān)鍵詞]Fas；FasL；嬰幼兒血管瘤；關(guān)系；演變

[中圖分類號]R732.2 [文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）07-0060-03

嬰幼兒血管瘤是一種常見的兒童期皮膚腫瘤，男女發(fā)病比例為1：（3～5），多發(fā)于嬰幼兒頭面部并表現(xiàn)為剛開始快速增長但后期增長減慢最終又會部分自行消退。近年來，業(yè)內(nèi)對于嬰幼兒血管瘤自行消退的機制一直為研究熱點，有學(xué)者已指出細(xì)胞凋亡途徑可能就是其自行消退的主要原因，而且細(xì)胞凋亡途徑中主要通路就是Fas/FasL蛋白介導(dǎo)的死亡受體通路。本研究通過對60例嬰幼兒血管瘤標(biāo)本進行檢測，研究其Fas和FasL蛋白及mRNA的表達(dá)情況并找出其中的關(guān)聯(lián)性，現(xiàn)報道如下。

1資料和方法

1.1一般資料：選取2010年1月2016年12月在筆者單位住院的嬰幼兒血管瘤標(biāo)本60例，所有入選的標(biāo)本患兒均為未經(jīng)過治療且單純進行手術(shù)切除制備石蠟標(biāo)本，患兒年齡2～120個月，依據(jù)患兒病理標(biāo)本的形態(tài)將60例標(biāo)本分成6份，分別為增生早期、中期和晚期及消退早期、中期和消退晚期。增生早期6例標(biāo)本，患兒年齡2～3個月；增生中期8例標(biāo)本，患兒年齡4～6個月；增生晚期16例標(biāo)本，患兒年齡7～12個月；消退早期標(biāo)本10例，患兒年齡12～36個月；消退中期8例標(biāo)本，患兒年齡36～60個月；消退晚期標(biāo)本12例，患兒年齡60個月以上，所有標(biāo)本均是石蠟包埋。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色所需試劑：抗Fas和抗FasL抗體（北京中杉生物技術(shù)有限公司），隸屬兔源性多克隆抗體；二抗：羊抗兔多聚酶標(biāo)二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記。

1.2.2 RT-PCR所需試劑：Fas、FasL和β-ActinPCR引物設(shè)計序列，如表1所示。合成公司，中科院上海生物工程中心；PCR Ex Taq酶反應(yīng)系統(tǒng)，日本TaKaRa公司；抽提RNA和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript 1T，美國Gibco公司。

1.2.3免疫組化染色方法：實驗前將標(biāo)本用機器制成病理切片，約為4um厚度。對其進行Envision法免疫組化染色，各個免疫組化染色指標(biāo)用PBS液作為陰性對照，將細(xì)胞胞漿內(nèi)或細(xì)胞外基質(zhì)中出現(xiàn)棕黑色或棕黃色物定義為陽性，其余為陰性。

1.2.4 RT-PCR：將標(biāo)本進行總RNA抽提并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用PCR儀進行擴增，條件是90s94℃-30s50℃-30s72℃，總共30個循環(huán)，最后5min延伸時間，將擴增后的溶液進行瓊脂糖凝膠電泳并對凝膠圖進行吸光度值分析，每個樣品均檢測3次，計算公式如下：mRMA表達(dá)相對量=目的基因片段條帶的吸光度A值/同一樣本β-Actin條帶的吸光度A值。

2結(jié)果

2.1免疫組化染色：通過表1可以看出，F(xiàn)as蛋白在增生早期和中期時有部分表達(dá)量，細(xì)胞飽滿、致密，部分細(xì)胞有棕黃色染色，且陽性細(xì)胞數(shù)目增多，在增生晚期時陽性細(xì)胞增多，但從消退早期至晚期，F(xiàn)as表達(dá)量呈下降趨勢，且微血管內(nèi)皮細(xì)胞仍有微弱陽性染色；FasL蛋白的表達(dá)從增生中期開始，呈現(xiàn)少數(shù)陽性細(xì)胞，有的陽性細(xì)胞位于血管壁中，直到增生晚期時FasL蛋白表達(dá)量達(dá)到最大表達(dá)，陽性細(xì)胞增多，且均在細(xì)胞密集之處；從消退早期到晚期，F(xiàn)asL表達(dá)量呈下降趨勢，直至幾乎看不見陽性細(xì)胞。

2.2 RT-PCR：通過對Fas和FasL蛋白mRNA的電泳圖進行觀察，可以發(fā)現(xiàn)Fas mRNA在增生早期和中期有一定量表達(dá)，在增生晚期達(dá)到最高，進入消退期開始下降，等到消退完成其幾乎檢測不到，F(xiàn)asL mRNA從增生中期開始有少量表達(dá)并在增生晚期表達(dá)到最高，進入消退期仍然很高但在消退完成期又幾乎檢測不到，通過進行吸光度值分析可發(fā)現(xiàn)Fas和FasL蛋白的mRNA含量均是先升后降。增生早期、增生中期、增生晚期、消退早期和消退晚期患兒的臨床表現(xiàn)，見圖1。

3討論

哺乳動物細(xì)胞凋亡主要通過死亡受體通路和線粒體通路進行，其中死亡受體途徑主要涉及蛋白為Fas/FasL、caspase8和TNF等，線粒體途徑主要涉及蛋白為easpase9、細(xì)胞色素C和BAX等，這兩條途徑都是通過caspase3來完成最終的細(xì)胞凋亡，有學(xué)者經(jīng)過大量實驗證明線粒體途徑不會在血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用，因為在血管瘤中線粒體涉及蛋白均表達(dá)量低而且在增殖期和消退期均無明顯變化差異，故死亡受體途徑可能會在血管瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮主要作用。CTL、Th1和NK細(xì)胞均會產(chǎn)生FasL，這些細(xì)胞數(shù)量增多和活性增強會促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生，有文獻表明T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的數(shù)量在血管瘤增殖期和消退期中明顯多于其消退晚期，在增殖早期嬰兒血管瘤細(xì)胞中的CD3+、CD4+和CD8+數(shù)量比較少，但到了增殖中期這三個指標(biāo)數(shù)量就顯著增多，等到消退晚期這三個指標(biāo)數(shù)量又顯著下降，并通過對微血管壁進行觀察發(fā)現(xiàn)上面有少數(shù)FasL+存在，說明其正在穿過微血管進入細(xì)胞團或者正與微血管壁細(xì)胞發(fā)生作用，故由此可以推出增生晚期細(xì)胞凋亡數(shù)量增多的原因是FasL的Tc和Th1的增多，所以說嬰幼兒血管瘤演變的重要因素是Fas和FasL蛋白介導(dǎo)免疫和凋亡機制，其演變過程應(yīng)屬于腫瘤免疫范圍。

嬰幼兒的免疫狀態(tài)也是其血管瘤細(xì)胞凋亡的一個重要影響因素，因為剛出生的胎兒其免疫系統(tǒng)尚未完全建立，其各種免疫細(xì)胞含量少，尤其由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和樹突狀細(xì)胞功能弱或不完全，再加上此時嬰幼兒不能通過胎盤獲得母體的免疫因子，故胎兒出生后對外來和內(nèi)在抗原的免疫應(yīng)答能力低，近而容易誘發(fā)患兒出現(xiàn)血管瘤，而且有數(shù)據(jù)表明早產(chǎn)低體重兒血管瘤發(fā)病率極高，這都可以用新生兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全來解釋。隨著嬰幼兒免疫系統(tǒng)的建立逐步完善，T細(xì)胞開始分泌FasL和Fas受體促使嬰幼兒血管瘤細(xì)胞凋亡并降低血管瘤生長速度。患兒早期血管瘤的微血管是由內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞包圍形成，當(dāng)患兒的體內(nèi)免疫系統(tǒng)建立起來后T細(xì)胞通過識別周細(xì)胞并分泌大量FasL促使其凋亡，血管周圍的周細(xì)胞數(shù)量在消退早期時會降至很低，而致敏性T細(xì)胞也使得血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞大量凋亡，這些均可以用來解釋消退早期微血管迅速閉塞并消失的原因。

綜上所述，F(xiàn)as和FasL通過介導(dǎo)血管瘤細(xì)胞凋亡途徑來使嬰幼兒血管瘤自行消退，它們之間存在著密切聯(lián)系。endprint