Stra8過表達精原細胞的細胞周期同步化方法的建立*

申雪沂 郭佳倩 牛長敏 馬海濤 夏 靜 夏蒙蒙 王建軍 鄭 英

揚州大學醫學院組織學與胚胎學教研室（江蘇揚州 225000）

細胞周期分為G1期（DNA復制前期）、S期（DNA復制期）和M期（DNA復制后期），細胞進入或退出細胞周期的某一階段受多種因素調節，因而研究細胞周期調節蛋白功能需要對細胞進行同步化處理。細胞周期同步化的方法包括物理方法或化學方法，其中化學方法，是指應用化學藥物將細胞可逆的阻滯在特定時相[1,2]。不同細胞具有不同的細胞周期同步化方法，其中Hela細胞是經典且最常用的生物研究用細胞株。由于Hela細胞具有能夠高效同步化到不同周期的優勢，因此廣泛用于細胞周期的研究且方法較為成熟[3]。

維生素A在哺乳動物多種生理過程中發揮重要作用，飲食中的維生素A一般儲存于肝臟，以視黃醇（retinol，ROL）的形式在血液中運輸，其活性形式為視黃酸（retinoic acid，RA），RA對于正常的精子發生過程必不可少[4,5]。Stra8（stimulated by retinoic acid 8，Stra8）是RA的反應基因之一，該基因在小鼠胚胎和出生后性腺中特異性表達[6,7]。據研究表明，Stra8蛋白可同時表達于生殖細胞的胞漿和胞核內，并根據細胞的狀態不同在核質進行穿梭，從而發揮不同的功能[8,9]。目前關于Stra8過表達精原細胞的周期同步化方法還未見報道。本實驗室在前期研究中建立了Stra8過表達精原細胞株， 在本研究中，主要參照Hela細胞探索Stra8過表達精原細胞的細胞周期同步化的方法 ，為后續Stra8在精原細胞中的作用機制研究提供實用性技術方法。

材料與方法

一、方法與材料

Stra8過表達精原細胞株（以下簡稱Stra8-GC1)為本實驗室前期工作中建立。DMEM基礎培養基，胰酶，PBS均購自WISENT試劑公司，胎牛血清購自Hyclone公司，青霉素/鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司。細胞周期同步化試劑：胸苷（Thymidine），諾考達唑（Nocodazole），PI（Propidium iodide）均購自美國SIGMA試劑公司，RNaseA購自北京天根生化有限公司。Triton X-100購自BIOSHARP試劑公司。

二、細胞培養方法

細胞傳代以后，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃，5%CO2培養箱內培養2～3d，當融合率達到85%以上時，再次傳代。

三、細胞周期同步化方法

（一）G1期細胞同步化方法

選取細胞融合率在20%～30%的Stra8-GC1， 用無血清DMEM培養基替換正常培養液，在37℃，5%CO2培養箱內分別培養24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h，收集細胞，70%酒精固定過夜，流式細胞儀檢測細胞周期。

（二）S期細胞同步化方法

選取細胞融合率在20%～30%的Stra8-GC1， 用含有 2.5mmol/L胸苷的培養液，在37°C，5%CO2培養箱內培養14～16h，更換正常培養液，繼續培養9h，再用含有2.5mmol/L胸苷的培養液培養14～16h，再次更換正常培養液分別培養 0、3h、6h、9h，收集細胞，70%酒精固定過夜，流式細胞儀檢測細胞周期。

（三）M期細胞同步化方法

選取細胞融合率在80%～90%的Stra8-GC1， 用含有 100ng/ml諾考達唑的培養液，在37℃，5%CO2培養箱內分別培養4h、8h、12h，應用物理震蕩（“shake off”）的方法收集細胞，70%酒精固定過夜，流式細胞儀檢測細胞周期。

（四）流式細胞儀細胞周期檢測

取固定過夜的細胞，4500rpm，離心3min，棄上清，用預冷PBS洗一次，棄上清。加入250 μL PI染液（含終濃度為50μg/mL的PI，20μg/mL 的RNaseA，1%Tritonx-100），混合后重懸細胞，避光4℃染色20min。使用流式細胞儀對不同處理條件下細胞進行細胞周期分析，每個樣品細胞數至少為1×104個，使用ModFit LTTM軟件對結果進行分析。

二、實驗結果

（一）常規顯微鏡觀察

1.3 樣本處理 每位研究對象均空腹采集EDTA抗凝血2 mL和促凝血3 mL，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測使用EDTA抗凝血，促凝血1 610 g×10 min離心后分離血清，-70℃儲存待用。

Stra8-GC1細胞在剝奪血清后增殖均正常，在72h無血清培養后，細胞透明度增加，細胞增殖速度減慢，細胞變小；在加入胸苷培養后，細胞明顯變大變圓，換正常培養液后細胞形態恢復正常；在加入諾考達唑之后，可觀察到細胞進入分裂期，正在分裂的細胞貼壁不緊密，輕拍可掉落。

（二） 流式細胞儀檢測結果

1. 無血清培養法同步化Stra8-GC1細胞至G1期：應用無血清培養阻斷細胞至G1期，分別收集阻斷24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h的細胞進行流式細胞儀檢測樣品中G1細胞所占比例，結果顯示無血清阻斷72h G1細胞數量最多，如圖1結果所示，圖1A為未同步化的正常細胞，G1期細胞比例為31.73%，圖1B為無血清阻斷法處理的細胞，G1期細胞比例在60%～70%，經統計學分析，兩者具有顯著差異（P＜0.05）。

2. 胸苷阻滯法同步化Stra8-GC1細胞至S期：應用胸苷阻滯細胞至S期，分別收集阻滯法處理后第二次培養0，3，6，9h的細胞進行流式細胞儀檢測樣品中S期細胞所占比例，結果顯示胸苷阻滯法處理后,第二次釋放培養3h，收集的細胞中S期細胞數量最多，如圖2結果所示，圖2A為未同步化的正常細胞，S期細胞比例為38.50%，圖2B為胸苷阻滯處理的細胞，S期細胞比例在60%～70%,經統計學分析，兩者具有顯著差異（P＜0.05）。

圖1 無血清饑餓法同步化Stra8過表達精原細胞至G1期

圖2 胸苷阻滯法同步化Stra8過表達精原細胞至S期

3. 諾考達唑阻滯法同步化Stra8-GC1細胞至M期：應用諾考達唑阻滯細胞至M期，收集阻滯法處理后培養4h、8h和12h的細胞，由于M期細胞具有貼壁疏松的特性，應用物理震蕩（“shake off”）的方法收集細胞進行流式細胞儀檢測樣品中M期細胞所占比例，結果顯示諾考達唑阻滯法處理8h，收集的細胞中M期細胞數量最多，如圖3結果所示，圖3A為未同步化的正常細胞，M期細胞比例為13.85%，圖3B為諾考達唑阻滯處理的細胞，M期細胞比例在90%以上，經統計學分析，兩者具有顯著差異（P＜0.05），達到較好的同步化效果。

圖3 諾考達唑阻滯法同步化Stra8過表達精原細胞至M期

討 論

研究細胞周期依賴性調節要素，進而闡明細胞增殖分裂的基本機制。將細胞群同步化至特定細胞周期具有多種細胞周期同步化方法，如血清剝奪、離心純化及藥物依賴性同步化等[10]。由于Hela細胞能夠應用不同方法進行細胞周期同步化[3]，因而參照Hela細胞，探索Stra8過表達精原細胞的細胞周期同步化方法。

將細胞阻滯在細胞周期S期的試劑有胸苷（2.5mM），羥基脲（HU：1mM）或阿非迪霉素 （1 μg/mL）。胸苷是最常見S期阻滯劑，它能減少核苷酸并抑制新DNA合成且毒性最小，在胸苷阻滯釋放之后更容易回到細胞周期[12]；HU能夠阻止核苷酸還原為脫氧核苷酸，選擇性地抑制DNA的合成[13]；阿非迪霉素能夠選擇性的抑制NDA聚合酶α的合成，影響核DNA修復和線粒體DNA復制[14]。但是應用HU或阿非迪霉素劑量較高或孵育時間較長，都可能導致DNA破壞，甚至細胞死亡[12]。因此，胸苷是S期細胞周期同步化的首選試劑，包括一次胸苷阻滯法和二次胸苷阻滯法，據文獻報道，Hela細胞應用二次胸苷阻滯法，首次釋放時間9h，足夠長使其細胞跨過S期, 第二次釋放時間為24h內每隔2h～3h收集細胞并進行細胞流式儀檢測，但是Hela細胞的S期細胞周期同步化的最佳第二次釋放時間還未見報道[3]。本研究在參照Hela基礎上，應用二次胸苷阻滯法同步化Stra8-GC1至S期，第二次釋放時間分別為0、3h、6h和9h，并分別收集細胞進行流式細胞儀檢測，結果顯示二次釋放時間3h后細胞的S期同步化效率最好，達60%～70%。

將細胞阻滯在細胞周期M期的的試劑包括秋水仙胺，諾考達唑等，其中諾考達唑通過阻滯微管裝配，在活性軸檢查點的中期終止有絲分裂，將細胞廣泛的阻滯在M期[2,12]。據文獻報道，Hela細胞應用0.3μmol/L（90ng/mL）處理18h后，能夠獲得較高純度M期細胞[15]。因此，本研究細胞周期同步化方法參照Hela細胞，最終應用100ng/mL諾考達唑分別處理Stra8-GC1細胞 4h、8h和12h，收集細胞并進行細胞流式儀檢測，發現處理8h后細胞的M期同步化效率最好，達90%以上。綜合考慮諾考達唑具有一定細胞毒性，培養時間和藥物濃度均不再提高，并應用物理震蕩方法收集細胞，從而提高細胞同步化效率，以及諾考達唑為非水溶性，因此我們應用DMSO配制諾考達唑，從而部分性降低諾考達唑細胞毒性作用[15]。

總之，在本研究中，通過參照Hela細胞同步化方法成功建立了Stra8過表達細胞株同步化方法，為之后Stra8在生精細胞不同細胞周期以及精子發生中的功能研究奠定了基礎。

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