基于基因表達譜篩查小鼠腦缺血再灌注后星形膠質細胞活化相關基因

董雯，王擁軍

中國卒中發病率和患病率在過去30年呈上升趨勢，我國仍是世界上腦血管疾病負擔第一大國[1]。其中缺血性卒中占卒中發病率的87%左右[2]。但是，目前對于急性缺血性卒中的治療，除美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的重組組織型纖溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA），尚無其他有效的神經保護劑進入臨床。rt-PA由于其嚴格的時間窗以及出血轉化等風險，發達國家僅有不到5%的缺血性卒中患者能受益[3]。因此，明確急性缺血性卒中損傷的分子機制，篩選出缺血性卒中后具有潛在神經保護作用的新干預靶點，具有重大的社會效益和科學價值。

腦組織細胞中，星形膠質細胞不僅為神經元提供營養、支持和信息傳遞，而且其終足包繞微血管內皮細胞，是連接神經元和微血管的重要中介，其在腦缺血再灌注損傷過程中的作用也逐漸受到關注[4]。本研究通過分析小鼠基因芯片結果，探尋急性腦缺血再灌注后星形膠質細胞活化的信號通路，擬篩查腦缺血再灌注后星形膠質細胞中的新干預靶點，為腦缺血再灌注后神經保護劑的開發提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 美國基因表達匯編（gene expression omnibus，GEO）數據庫中小鼠腦組織分離的星形膠質細胞基因表達譜芯片（Affymetrix Gene Chip Mouse Genome 430 2.0 Arrays）數據共8張，GEO編號為GSE35338。將8只醛脫氫酶1家族l1-綠色熒光蛋白（Aldehyde dehydrogenase 1 family member l1-Green Fluorescent Protein，Aldh1l1-GFP）轉基因小鼠分為腦缺血再灌注模型組（腦缺血1 h再灌注24 h）和假手術組，每組各4只。利用線栓法制作小鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，腦缺血1 h后將線栓從頸內動脈拔出實現再灌注。假手術組不插入線栓，其余操作同缺血再灌注組。再灌注24 h后，處死并取材腦組織，應用2’3’5’-氯化三苯基四氮唑（2’3’5’-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色驗證腦缺血再灌注模型成功。取腦缺血再灌注模型組缺血側和假手術組腦組織皮層，木瓜酶消化后，得到單細胞懸液，應用熒光激活細胞分離儀（fluorescence activated cell sorter，FACS）篩選的GFP陽性細胞即為星形膠質細胞。

每組芯片各4張。該芯片可檢測34 000個小鼠基因，較完整地覆蓋了小鼠全基因組表達譜。

1.2 差異基因的篩選 應用隨機方差模型（random variance model，RVM）t檢驗方法，對腦缺血再灌注組和假手術組表達譜芯片數據進行比較，通過計算兩組間基因差異的顯著性水平（P）和差異倍數（fold change）篩選兩組間表達水平有差異的基因。根據P＜0.05、fold change≥2進行篩選，得到差異基因。

1.3 信號通路分析（pathway analysis） 應用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫對基因參與的信號通路進行系統化分析，通過自適應線性向上（adaptive linear step up，ALSU）的方法控制假發現率（false discovery rate，FDR），分析具有顯著統計學意義的信號通路。

1.4 核心信號通路的篩選 基于KEGG數據庫中各信號通路的上下游關系，構建信號通路之間的相互作用網絡圖即信號通路關系網絡（pathway relation network，Path-net），分析參與腦缺血后星形膠質細胞活化的核心信號通路。度（Degree）值越大代表信號通路越靠近網絡圖的中心，即越核心。

1.5 統計學處理 依據P＜0.05且fold change≥2的標準，采用RVMt檢驗法篩選腦缺血再灌注組與假手術組間的顯著差異表達基因。應用Fisher精確檢驗對目標基因參與的信號通路進行顯著性分析，按照P＜0.05進行篩選，得到顯著性的信號通路。

2 結果

2.1 急性局灶性腦缺血再灌注損傷后星形膠質細胞中差異表達基因的篩選 通過對芯片數據分析，共篩選出1966個在急性局灶性腦缺血再灌注后差異表達的基因，其中表達上調的基因有1210個，表達下調的基因有756個。急性腦缺血再灌注后星形膠質細胞中，表達上調5倍以上的基因有208個；表達下調5倍以上的基因有6個。

根據芯片數據分析的結果，對腦缺血再灌注組和假手術組星形膠質細胞中差異表達基因進行聚類分析，以得到差異基因的聚類圖（圖1）。8例樣本被分為2組，前4列為腦缺血再灌注組，后4列為假手術組。應用不同顏色區分差異表達基因在腦缺血再灌注組與假手術組間的表達情況。腦缺血再灌注組與假手術組相比，紅色表示基因表達上調；綠色表示基因表達下調。由聚類分析圖可見紅色和綠色形成顯著的4個部分，并且同一基因在同組內表達情況相對一致，不同組間的基因表達存在明顯不同的聚類群。

2.2 急性局灶性腦缺血再灌注后星形膠質細胞中的核心信號通路 對腦缺血再灌注組和假手術組間差異基因參與的信號通路進行分析，按照P＜0.05進行篩選，得到154個差異表達的信號通路。通過信號通路關系網絡（pathway relation network，Path-net），根據Degree值由大到小排序，初步篩選出15條關鍵信號通路。其中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）信號通路的Degree值為34，在所有信號通路中的Degree值最大，其次為凋亡（apoptosis）、細胞周期（cell cycle）、p53信號通路（表1）。以MAPK信號通路為核心的信號通路網絡圖如圖2所示。

2.3 腦缺血再灌注后星形膠質細胞中起重要調節作用的基因 本研究進一步分析了MAPK、p53信號通路中起關鍵作用的差異基因。MAPK信號通路中的差異基因有31個；p53信號通路中有19個差異基因。對MAPK和p53信號通路的50個差異基因按照P值進行排序，以選擇在星形膠質細胞中起關鍵作用的基因。P值最小的兩個基因分別為細絲蛋白c（filamin，Flnc）和細胞周期蛋白d1（cyclin-dependent kinases，Ccnd1）（表2）。

圖1 差異基因聚類分析圖

表1 腦缺血再灌注后星型膠質細胞中15條關鍵信號通路

3 討論

本研究對腦缺血再灌注組和假手術組小鼠分離的星形膠質細胞中的基因表達譜進行分析。結果顯示，與假手術組相比，腦缺血再灌注組星形膠質細胞中有1966個差異表達基因。進一步分析發現，上調5倍以上的基因有208個，遠多于6個表達下調的基因。該結果提示，腦缺血再灌注激活星形膠質細胞中大量基因異常高表達。

信號通路是細胞內傳遞“信息”的關鍵網絡，它通過蛋白質間的相互作用影響細胞的生命活動。對差異基因參與的信號通路進行分析，發現了MAPK信號通路、p53信號通路、凋亡、細胞周期是在腦缺血再灌注后星形膠質細胞中起關鍵作用的信號通路。以往的研究表明，MAPK信號通路在許多細胞過程中發揮作用，如增殖、分化、應激反應、凋亡、自噬和存活[5]。而且，MAPK信號通路在腦缺血損傷中的作用逐漸受到關注[6]。

本研究通過對信號通路中差異基因的P值進行篩選，發現編碼CyclinD1的基因Ccnd1的P值（0.000 046）最小。CyclinD1是調控細胞周期的重要因子，促進細胞周期正向進行。已有研究表明，腦缺血后，腦組織星形膠質細胞中CyclinD1表達水平上調從而誘導細胞凋亡，最終導致腦缺血損傷[7-9]。

圖2 腦缺血再灌注后星形膠質細胞中信號通路關系網絡

表2 MAPK和p53信號通路中的差異基因

由Flnc基因編碼的細絲蛋白C（Filamin C），常表達于肌肉組織[10-11]；但也有研究發現其在中樞神經系統中大量表達[12-13]。MASAYO等[14]的研究表明，Filamin C在膠質瘤中表達明顯升高，且其表達水平與膠質瘤的分級程度相關。另外，細絲蛋白除與胞內多種骨架蛋白結合發揮細胞骨架作用之外，還與其他許多信號分子和受體結合，傳遞胞內信號，促使細胞遷移和黏附[15]，但是其在腦缺血再灌注后星形膠質中的作用還未見報道。本研究結果顯示，Flnc是腦缺血再灌注后星形膠質細胞活化過程中的關鍵差異基因，推測其可能成為保護腦缺血再灌注損傷的潛在靶點。

本研究結果對于深入探索腦缺血再灌注損傷后星形膠質細胞活化的分子機制、尋找神經保護新靶點，提供了一定的研究基礎。由于本文結論是基于小樣本數據分析得到的結果，后續需要增加樣本量或者在細胞、小動物水平進行實驗驗證。另外，Flnc參與腦缺血再灌注損傷的機制還有待進一步深入探究。

[1]WANG W，JIANG B，SUN H，et al. Prevalence，incidence，and mortality of stroke in China：results from a nationwide population-based survey of 480 687 adults[J]. Circulation，2017，35（8）：759-771.

[2]FAVATEAS，YOUNGER D S. Epidemiology of ischemic stroke[J]. Neurologic clinics，2016，34（4）：967-980.

[3]HACKEW，KASTEM，BLUHMKIE，et al. Thrombolysis with alteplase 3 to 4. 5 hours after acute ischemic stroke[J]. N Engl J Med，2008，359（13）：1317-1329.

[4]ARAI K，LOK J，GUO S，et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke[J]. J Chil Neuro，2011，26（9）：1193-1198.

[5]SUN Y，LIU WZ，LIU T，et al. Signaling pathway of MAPK/ERK in cell proliferation，differentiation，migration，senescence and apoptosis[J]. J Recept Signal Transduct Res，2015，35（6）：600-604.

[6]YAOB，WANGS，XIAOP，et al. MAPK signaling pathways in eye wounds：multifunction and cooperation[J]. Exp Cell Res，2017，359（1）：10-16.

[7]KATCHANOVJ，HARMSC，GERTZK，et al. Mild cerebral ischemia induces loss of cyclin-dependent kinase inhibitors and activation of cell cycle machinery before delayed neuronal cell death[J]. J Neurosci，2001，21（14）：5045-5053.

[8]KATOH，TAKAHASHIA，ITOYAMAY. Cell cycle protein expression in proliferating microglia and astrocytes following transient global cerebral ischemia in the rat[J]. Brain Res Bull，2003，60（3）：215-221.

[9]ZHUZ，ZHANGQ，YUZ，et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo[J]. Glia，2007，55（5）：546-58.

[10]STOSSELTP，CONDEELISJ，COOLEYL，et al. Filamins as integrators of cell mechanics and signalling[J]. Nature reviews. Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（2）：138-145.

[11]ZHOUAX，HARTWIGJH，AKYUREKLM. Filamins in cell signaling，transcription and organ development[J]. Trends Cell Biol，2010，20（2）：113-123.

[12]XIEZ，XUW，DAVIEEW，et al. Molecular cloning of human ABPL，an actin-binding protein homologue[J]. Biochem Biophys Res Commun，1998，251（3）：914-919.

[13]PUDASR，KIEMATR，BUTLERPJ，et al. Structural basis for vertebrate filamin dimerization[J]. Structure，2005，13（1）：111-119.

[14]ADACHI-HAYAMAM，ADACHIA，SHINOZAKIN，et al. Circulating anti-filamin C autoantibody as a potential serum biomarker for lowgrade gliomas[J]. BMC cancer，2014，14：452.

[15]NAKAMURAF，STOSSELTP，HARTWIGJH. The filamins：organizers of cell structure and function[J]. Cell Adh Migr，2011，5（2）：160-169.