螺旋藻激酶對急性血瘀模型大鼠的影響*

黃媛恒，覃斐章，李映新，原春蘭，蔣麗梅，王 琳，龐 輝△

(廣西醫科大學：1.基礎醫學院；2.藥學院；3.第一臨床醫學院，南寧 530021)

論著·基礎研究

螺旋藻激酶對急性血瘀模型大鼠的影響*

黃媛恒1，覃斐章2，李映新2，原春蘭3，蔣麗梅3，王 琳3，龐 輝1△

(廣西醫科大學：1.基礎醫學院；2.藥學院；3.第一臨床醫學院，南寧 530021)

目的探討螺旋藻激酶(SPK)對急性血瘀模型大鼠的血液流變學、血小板聚集率和環磷酸腺苷(cAMP)的影響。方法40只SD大鼠分為正常對照組、模型組、阿司匹林組和SPK高、低劑量組，灌胃給藥7 d，采用腎上腺素冰水浴刺激復制急性血瘀大鼠模型，應用全自動血流變測定儀檢測全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積(Hct)、紅細胞聚集指數(EAI)、紅細胞變形指數(DI)和紅細胞剛性指數(ERI)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血漿cAMP的水平，采用二磷酸腺苷誘導大鼠血小板聚集，用比濁法測定最大聚集率。結果SPK可以降低急性血瘀大鼠的全血黏度，血漿黏度、Hct、EAI和血小板最大聚集率，升高血漿cAMP水平，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，對DI和ERI無明顯影響。結論SPK能明顯改善急性血瘀大鼠血液流變學的異常變化且具有抗血小板聚集作用。

螺旋藻激酶；血瘀；血液流變學；血小板聚集；環磷酸腺苷

螺旋藻是天然海洋生物，廣泛分布于中國廣西、浙江、海南等省區，具有抗氧化、降血脂、抗衰老、抗損傷、提高免疫力等藥理作用[1]。筆者前期研究發現，螺旋藻經過發酵酶化干燥后，從中提取出一種具有蛋白激酶類活性成分，稱為螺旋藻激酶(spirulina kinase，SPK)，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定為電泳純，其相對分子質量為 40×103，屬于絲氨酸蛋白酶，結構中不含二硫鍵[2-3]。前期藥理作用研究表明其具有一定抗血栓、抗凝血及保護血管內皮細胞作用[4-6]。本實驗擬通過腎上腺素與冰水刺激復制急性血瘀大鼠模型，觀察SPK對血瘀證模型動物血液流變學、血小板聚集率的影響，并對血漿環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的水平進行了測定，為進一步開發SPK提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 清潔(SPF)級SD大鼠40只，雌雄各半，體質量(200±20)g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證SCXK桂2009-0002，實驗動物使用許可證SCXK桂2009-0004。主要試劑： SPK由本實驗室自行提取；阿司匹林腸溶片100 mg/片購自拜耳醫藥保健有限公司，批號BJ27607；鹽酸腎上腺素注射液購自上海禾豐制藥有限公司，批號201512；二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)購自Sigma公司，批號A2754；cAMP試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，批號L151201132。主要儀器：SA9000全自動血流變測試儀購自北京賽科希德科技發展有限公司；iMark酶標儀購自美國Bio-Rad公司；血小板功能檢測儀700購自美國Chrono-Log公司；TGL-16A冷凍離心機購自長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組和給藥 40只SD大鼠分為5組，即正常對照組、模型組、阿司匹林組(0.1 g/kg)和SPK高、低劑量組(1.0、0.5 g/kg)，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水，灌胃給藥，每天1次，連續7 d。

1.2.2模型制備[7]第6天給藥后30 min，除正常對照組大鼠外，其余各組大鼠均皮下注射鹽酸腎上腺素0.8 mg/kg，2 h后將大鼠浸入0～5 ℃冰水中5 min，2 h后再按0.8 mg/kg皮下注射鹽酸腎上腺素以復制急性血淤模型，正常對照組大鼠僅皮下注射等容積生理鹽水且不給予冰水刺激；所有禁食不禁水12 h。

1.3檢測指標 第7 天末次給藥30 min，各組大鼠以水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，肝素抗凝全血用全自動血流變速測定儀檢測血液流變學指標：包括全血黏度(1/s、50/s、200/s)、血漿黏度、紅細胞壓積(Hct)、紅細胞變形指數(DI)、紅細胞聚集指數(EAI)及紅細胞剛性指數(ERI)；另取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，4 ℃，3 500 r/min，離心15 min，分離血漿，用ELISA法檢測cAMP水平，按試劑盒說明書操作；以3.8%枸櫞酸鈉抗凝，全血以1 000 r/min離心10 min， 取其上清液即為富血小板血漿，余下部分以3 000 r/min離心10 min，取其上清液即為貧血小板血漿，按Born比濁法測定二磷酸腺苷(ADP)誘導的血小板最大聚集率。

2 結 果

2.1SPK對血瘀證模型大鼠血液流變學的影響 與正常對照組比較，模型組全血低、中、高切黏度、血漿黏度、Hct、EAI均明顯增高，DI和ERI下降；高劑量SPK(1.0 g/kg)能明顯降低全血低、中、高切黏度，并能降低血漿黏度、EAI、Hct，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而對DI和ERI無明顯影響，見表1、2。

2.2SPK對血瘀證模型大鼠ADP誘導血小板聚集率的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠血小板聚集率明顯升高。與模型組比較，SPK高劑量組(1.0 g/kg)對ADP誘導的血小板聚集率有明顯抑制作用(P<0.05)，見表3。

表1 SPK對急性血瘀大鼠全血黏度的影響

a：P<0.05，與模型組比較

表2 SPK對急性血瘀大鼠血漿黏度、Hct、EAI、DI、ERI的影響

a：P<0.05，與模型組比較

2.3SPK對血瘀證模型大鼠血漿cAMP水平的影響 模型組大鼠血漿cAMP水平為(140.74±15.55) pg/L，與正常對照組相比，明顯下降。與模型組比較，SPK高劑量組(1.0 g/kg)能明顯提高大鼠血漿cAMP水平，見表3。

表3 SPK對ADP誘導的急性血瘀大鼠血小板聚集率、 血漿cAMP水平的影響

a：P<0.05,b：P<0.01，與模型組比較。

3 討 論

現代藥理學研究表明，血栓形成的重要原因有血管內皮細胞的損傷、血小板聚集及相關活化因子的釋放，纖溶活性的降低，血液黏度的增大，血流狀態的改變等。目前臨床上血液的濃、黏、凝、聚是造成血栓的主要原因。可見，血液流變學的改變在血栓形成過程也起了關鍵作用，它主要反映由于血液成分變化而帶來的血液流動性、凝滯性和血液黏度的變化。血液流變學的異常在許多疾病的發生發展發揮重要的作用，研究表明患高血壓、高血脂、急性心肌梗死、冠狀動脈疾病、腦卒中等人群均出現血液流變學異常[8-11]。

血瘀就是一組血液循環障礙或血液流變學行為異常的疾病。皮下注射腎上腺素加冰水浸泡復制的大鼠急性血瘀模型，表現出血液高凝、全血黏度增加等血液流變學的異常變化[12]。血液流變學的改變通常應用全血黏度、血漿黏度、Hct、纖維蛋白原定量、DI和EAI等指標來反映。血液里的細胞成分(血小板、紅細胞)和血漿里的成分(糖、脂、纖維蛋白原)的變化會導致血液流變性的改變。全血黏度是反映血液流變性最重要的指標，受血漿黏度、血小板聚集性、Hct、紅細胞聚集性和變形性等影響，而血漿黏度由血漿蛋白濃度、形式決定。本研究結果顯示急性血瘀大鼠血液流變學發生異常改變，由ADP誘導劑誘導的血小板聚集率明顯升高，SPK可以降低急性血瘀大鼠的全血高、中、低切黏度，降低血漿黏度、Hct和EAI，以及抑制血小板的聚集。同時，本實驗觀察了血瘀大鼠血漿cAMP的水平。cAMP作為血小板的第二信使對血小板功能的調節起重要作用，cAMP主要通過降低細胞內 Ca2+水平、抑制血小板肌球蛋白磷酸化、促進前列腺素E2(PGE2)和前列腺A2(PGI2)的合成、抑制血栓素(TXA2)合成及抑制凝血酶與其受體結合等抑制血小板的活化[13]，從而影響血小板聚集功能，在血液高凝態和微循環障礙的發展過程中有重要的意義。因此當cAMP水平降低，則可促進血小板聚集，易致血液高凝態，結果顯示急性血瘀大鼠cAMP水平明顯下降，SPK可升高cAMP水平，推斷其抑制血小板聚集可能與之有關，具體機制有待進一步研究。

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TheeffectsofSpirulinakinaseinratswithacutebloodstasis*

HuangYuanheng1,QinFeizhang2,LiYingxin2,YuanChunlan3,JiangLimei3,WangLin3,PangHui1△

(1.CollegeofBasicMedicine;2.Collegeofpharmacy;3.CollegeofFirstClinicalMedical,GuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China)

ObjectiveIn this study,the effect of Spirulina kinase(SPK)on hemorheology,platelet aggregation and cAMP in acute blood stasis rats model were investigated.MethodsForty SD rats were randomly divided into normal control group,model group,aspirin group and the high and low dose of SPK groups.All treatments were performed by gavage once a day for 7 days.Subcutaneous injection of adrenalin combined with ice water bath were used to establish the acute blood stasis rat model.The whole blood viscosity,plasma viscosity,red blood cell hematocrit (Hct),erythrocyte aggregation index (EAI),red blood cell deformation index(DI)and erythrocyte rigidity index(ERI) were detected by automatic blood flow speed analyzer.Meanwhile,the level of cAMP was detected by ELISA method.Rat platelet aggregation induced by ADP and the maximum aggregation rate was measured by turbidimetry.ResultsResults showed that SPK could significantly decrease the whole blood viscosity,plasma viscosity,Hct,EAI and platelet aggregation rate,increase the level of cAMP compared with model group(P<0.05),but had no effect on DI and ERI.ConclusionSPK can markedly improve the abnormal changes of hemorheology in acute blood stasis rats and inhibit the platelet aggregation.

] Spirulina kinase;blood stasis；hemorheology;platelet aggregation;cAMP

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.003

廣西自然科學基金資助項目(2014GXNSFBA118156，2014GXNSFBA118188，2013GXNSFAA019176)；2013年廣西壯族自治區區級大學生創新創業訓練計劃項目(桂教高教[2013]14號)。

黃媛恒(1982-)，講師，碩士，主要從事生化藥理學研究。△

，E-mail:454720524@qq.com。

R963

A

1671-8348(2017)36-5047-02

2017-07-06

2017-08-08)